薩茹拉 吳玉小 吳偉紅 白 珍 白長喜

(1 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津，300193； 2 內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院，呼和浩特，010065； 3 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥研究所，呼和浩特，010020)

胃潰瘍出血屬于上消化道出血，胃損傷、潰瘍是導(dǎo)致胃出血的常見原因[1]。胃潰瘍及消化性潰瘍是一種常見的消化道疾病。主要的病因由幽門螺旋桿菌感染和藥物及飲食因素導(dǎo)致。如長期服用阿司匹林、皮質(zhì)類固醇等藥物及長期吸煙、飲酒、喝濃茶、咖啡等易致此病發(fā)生。出血是胃潰瘍最常見的并發(fā)癥，是潰瘍基底血管被侵蝕破裂所致，因此止血與促進(jìn)潰瘍修復(fù)、愈合是胃潰瘍合并出血治療的關(guān)鍵手段[2]。

蒙醫(yī)學(xué)認(rèn)為胃潰瘍出血屬“血病”的一種，蒙醫(yī)藥治療“三根”失調(diào)導(dǎo)致的胃潰蕩出血有著豐富的經(jīng)驗(yàn)和獨(dú)到的特色，在蒙醫(yī)學(xué)理論體系中，胃潰瘍出血的病因?yàn)轱嬍巢还?jié)，邪熱傷肝，水谷精不能化，惡血激增溢于胃，血不循徑，三根失調(diào)導(dǎo)致[3]。本實(shí)驗(yàn)為了探討蒙藥熊膽及主要有效成分治療胃潰瘍出血性模型大鼠對(duì)潰瘍基底血管被侵蝕破裂出血后止血與促進(jìn)潰瘍修復(fù)、愈合等作用進(jìn)行初步觀察。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SD大鼠130只，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0004。

1.1.2 藥物 熊膽粉(0.25 g/瓶×4瓶)(福建歸真堂藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字Z10980024)；熊去氧膽酸(上海生工生物工程股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：BB07BA0324)；牛磺熊去氧膽酸(上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：3MQWC-BP)；膽酸(美國Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)：SLBH1420V)止血紅花-8味散(內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院國家蒙藥制劑中心生產(chǎn)，呼衛(wèi)制注字(97)001-133號(hào))；吲哚美辛膠囊(消炎痛，湖北東信藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H42021462)；奧美拉唑腸溶膠囊20 mg(石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20046430)。

1.1.3 試劑與儀器 5-HT ELISA KIT，規(guī)格：96T，產(chǎn)品編號(hào)：E02H0106；AngⅡ ELISA KIT，規(guī)格：96T，產(chǎn)品編號(hào)：E02A0204；VEGF ELISA KIT，規(guī)格：96T，產(chǎn)品編號(hào)：E02V0010；均由美國R&D公司生產(chǎn)。無水乙醇500 mL(天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠)；甲醛溶液500 mL(天津虔誠偉業(yè)科技發(fā)展有限公司)；超凈工作臺(tái)；電子天平；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(MULTISKAN MK3，Thermo，USA)；水平離心機(jī)；MK3型酶標(biāo)儀；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH4000A，天津泰斯特)；MINI shaker(MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER)；移液器；EP(0.1 mL，0.2 mL，1 mL)等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 模型釆用吲哚美辛加無水乙醇法建立實(shí)驗(yàn)性大鼠應(yīng)激性胃潰瘍出血模型，將130只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、奧美拉唑組、止血紅花-8味散低和高劑量組、熊膽粉低和高劑量組、熊去氧膽酸(UDCA)低和高劑量組、牛磺熊去氧膽酸(TUDCA)低和高劑量組、膽酸(CA)低和高劑量組，10只/組。

1.2.2 給藥方法 空白組和模型組灌胃等容積的0.9%氯化鈉注射液，止血紅花-8味散低劑量組270.1 mg/kg、止血紅花-8味散高劑量組539.9 mg/kg、熊膽粉及其主要成分低和高劑量組分別以45.7 mg/kg、91.5 mg/kg濃度的量每100 g大鼠1 mL的灌胃量灌胃(止血紅花-8味散由熊膽50 g、藏紅花50 g、菀豆花40 g、紅檀35 g、地錦草35 g、石斛35 g、制木鱉子25 g、朱砂25 g等8味藥組成。由止血，清熱，涼血功能。主治“寶日”病，胃腸出血，外傷流血，流鼻血，吐血，月經(jīng)過多等多種出血癥。1～3次/d，1.5～3 g/次，溫開水送服。大鼠灌胃劑量為臨床給藥劑量按人的平均體質(zhì)量70 kg計(jì)算，根據(jù)人和大鼠給藥劑量系數(shù)換算得出)；連續(xù)給藥7 d后，禁食24 h，胃出血造模用吲哚美辛(消炎痛)加乙醇法，ip消炎痛7.5 mg/mL，1 mL/100 g體質(zhì)量，0.5 h后，觀察組分別灌胃相應(yīng)藥物，1 mL/100 g體質(zhì)量，空白組灌胃等容積的0.9%氯化鈉注射液，3 h后重復(fù)灌胃1次，第2次灌胃2.5 h后，模型組和觀察組再灌胃50%乙醇，1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 末次給藥后1 h，用乙醚將大鼠致昏迷，背位固定，心臟穿刺取血5 mL，在室溫放置2 h后3 000 r/min離心10 min，取上清液得到待測血清。嚴(yán)格按照各個(gè)試劑盒說明書步驟操作，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)雙抗體夾心法，測定血清5-HT、AngⅡ和VEGF的水平。

2 結(jié)果

2.1 蒙藥熊膽及主要成分對(duì)血小板計(jì)數(shù)的影響 空白組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組與空白組、奧美拉唑組、蒙藥熊膽及主要成分觀察組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。熊膽粉低和高劑量組、UDCA高劑量組、TUDCA低和高劑量組與奧美拉唑組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 蒙藥熊膽及主要成分對(duì)血小板計(jì)數(shù)的影響

注：與空白組比較*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與奧美拉唑組比較，▲P>0.05

2.2 蒙藥熊膽及主要成分對(duì)大鼠血清的影響 與空白組比較，5-HT其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，AngⅡ除奧美拉唑組和UDCA高劑量組外，其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，VEGF除奧美拉唑組和TUDCA高劑量組外，其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，5-HT其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，AngⅡ除CA低劑量組外，其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，VEGF除止血-8低劑量組、熊膽粉低劑量組、CA低劑量組和CA高劑量組外，其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

圖1 空白組SD大鼠胃組織形態(tài)(HE，×20)圖2 模型組SD大鼠胃組織形態(tài)(HE，×20)

圖3 奧美拉唑組SD大鼠胃組織形態(tài)(HE，×20)圖4 止血?8低組SD大鼠胃組織形態(tài)(HE，×20)

圖7 熊膽粉高組SD大鼠胃組織形態(tài)(HE，×20)圖8 UDCA低組SD大鼠胃組織形態(tài)(HE，×20)

圖9 UDCA高組SD大鼠胃組織形態(tài)(HE，×20)圖10 TUDCA低組SD大鼠胃組織形態(tài)(HE，×20)

圖13 CA高組SD大鼠胃組織形態(tài)(HE，×20)

2.3 蒙藥熊膽及主要成分對(duì)胃組織病理學(xué)觀察 HE染色顯示，空白組大鼠胃壁組織在光鏡下可見黏膜層、黏膜下層、肌層及外模層結(jié)構(gòu)連續(xù)、完整；黏膜層腺體排列緊密、整齊；上皮細(xì)胞形態(tài)正常、無炎性細(xì)胞浸潤、上皮脫落等表現(xiàn)。模型組大鼠黏膜層結(jié)構(gòu)紊亂、胃腺體排列疏松、腺上皮細(xì)胞水腫，黏膜上皮缺失、片狀脫落、局部可見炎性細(xì)胞；固有層微血管充血、炎性細(xì)胞浸潤明顯；黏膜下層疏松水腫、可見炎性細(xì)胞滲出。觀察組大鼠胃黏膜層炎性細(xì)胞減少，平滑、肉芽的增生，有新生血管、固有膜上有新生修復(fù)的腺體，腺體的再生變得有規(guī)模。見圖1～13。

表2 蒙藥熊膽及主要成分對(duì)大鼠血清5-HT，AngⅡ，VEGF的影響

注：與空白組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與奧美拉唑組比較，▲P>0.05

3 討論

胃潰瘍疾病在臨床上屬于常見病，出血是胃潰瘍最常見的并發(fā)癥。吲哚美辛(消炎痛)是易致胃潰瘍藥品中激素替代品類的一種，對(duì)胃黏膜有直接的損害作用，可引起胃炎、淺表潰瘍、急性胃潰瘍、十二指腸炎、胃腸黏膜糜爛而致出血，甚至穿孔。乙醇致大鼠胃潰瘍模型由19世紀(jì)Beaumont就已發(fā)現(xiàn)過度飲酒對(duì)胃黏膜有明顯損害作用[4]。乙醇濃度越高，乙醇灌胃后引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胃黏膜上皮細(xì)胞的變性、壞死以及間質(zhì)血管瘀血損傷會(huì)逐漸加重。乙醇可溶解脂肪的化合物，破壞胃黏膜屏障的脂蛋白層，保護(hù)性物質(zhì)減少引起黏膜細(xì)胞損傷；乙醇可引起黏膜下血管內(nèi)皮損傷，血管擴(kuò)張、黏膜下出血等改變。陽性對(duì)照組藥奧美拉唑適用于胃潰瘍十二指腸潰瘍應(yīng)激性潰瘍返流性食管炎和卓-艾綜合征(胃泌素瘤)，靜脈注射可用于消化性潰瘍急性出血的治療。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為的止血藥作用有收縮血管、降低毛細(xì)血管通透性，激活凝血因子，促進(jìn)血小板生成黏附聚集，抗纖維蛋白溶解等主要4種。機(jī)體正常止血與凝血機(jī)制有賴于血管壁、血小板、凝血因子、抗凝因子、纖容系統(tǒng)以及他們之間的生理性調(diào)解和平衡[5]。

本研究中我們通過觀察蒙藥熊膽及主要成分對(duì)大鼠血小板、血清5-HT、AngⅡ及VEGF的影響初步了解到治療胃潰瘍出血性模型大鼠的作用機(jī)制。5-HT又稱血清素，其活性部分是吲哚胺。它廣泛存在于腦、血小板、胃等組織中，是較強(qiáng)的平滑肌和血管收縮劑。在血小板中含量較高，血小板破裂釋放后參與血管收縮等效益。促血管生成素(Ang)家族是近年來發(fā)現(xiàn)的與血管生成及血管成熟有關(guān)的因子，包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是一種多膚類激素，是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的一種主要活性成分，以往僅被作為一種縮血管物質(zhì)，目前己有很多試驗(yàn)結(jié)果提示AngⅡ誘導(dǎo)的血管生成的作用機(jī)制可能是通過AT1R增加VEGF的產(chǎn)生，上調(diào)Ang-2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的[6-9]。VEGF是一種特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并能促進(jìn)其有絲分裂的糖蛋白，能直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用，同時(shí)VEGF能增加血管通透能力，有利于血漿纖維蛋白外滲，進(jìn)而促進(jìn)血管生成達(dá)到止血目的。此外VEGF的促血管生成作用也有積極作用的一面，其在組織修復(fù)方面也有積極的作用。目前大量研究也證實(shí)VEGF在潰瘍修復(fù)中對(duì)潰瘍基底肉芽組織生長和新血管形成起到了重要的促進(jìn)作用。說明VEGF確實(shí)參與了胃潰瘍的愈合過程，也進(jìn)一步表明胃潰瘍愈合過程中需要形成微血管以便輸送氧和營養(yǎng)物質(zhì)等，而VEGF可能在此過程中起了重要作用[10]。通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，蒙藥熊膽及主要成分UDCA、TUDCA能顯著提高血小板計(jì)數(shù)及降低血清5-HT、AngⅡ及VEGF水平，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CA作用較弱，表明蒙藥熊膽及主要成分UDCA、TUDCA是通過提高血小板計(jì)數(shù)、促進(jìn)血管收縮而發(fā)揮止血作用。是降低毛細(xì)血管的通透性從而縮短凝血時(shí)間，或者直接作用于血管平滑肌，收縮毛細(xì)血管、小動(dòng)脈、小靜脈，減少內(nèi)臟血流量，促進(jìn)血管破損處的血凝過程并形成凝塊，有利于血漿纖維蛋白外滲，進(jìn)而促進(jìn)血管生成達(dá)到止血作用。熊膽的主要成分UDCA、TUDCA的這種作用與熊膽基本相似，提示蒙藥熊膽的這種止血作用的主要成分為UDCA和TUDCA。本研究結(jié)果對(duì)于熊膽的科學(xué)、合理應(yīng)用及從熊膽開發(fā)新藥提供科學(xué)依據(jù)。

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