張艷萍，令利軍，趙 瑛，厚毅清

（1.甘肅省農業(yè)科學院生物技術研究所，甘肅 蘭州 730070；2.西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州 730070）

馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉［Phytophthora infestans（Mont.）de Bary］引起的一種毀滅性的病害，嚴重影響著馬鈴薯的產量和品質［1-2］。目前，馬鈴薯晚疫病防治主要包括化學防治、抗病育種等［3］。隨著科學技術不斷發(fā)展進步，利用生物種間關系、種內關系，調節(jié)有害生物種群密度的生物防治手段越來越受到人們的重視，這種生物防治措施具有安全、有效和無污染等特點，與保護生態(tài)環(huán)境和社會協(xié)調發(fā)展的要求相吻合［4］。

我們從土壤中分離得到1株對馬鈴薯晚疫病菌具有良好抑制作用的假單胞菌，并命名為HC5。假單胞菌在自然界分布廣泛，種類繁多，是植物根際土壤周圍起生物防治功能的主要細菌類群［5］。目前，關于假單胞菌的應用研究有了大量的報道［6-12］，它們可以產藤黃綠膿素（pyoluteorin，Plt）、吡咯菌素（pyrrolnitrin，Prn）、1-羧基吩嗪（phenazine-lcaboxylic acid，PCA） 等多種抗生素，對多種病菌具有拮抗作用［13］，涉及領域包括用于農業(yè)生物防治、植物生長調節(jié)、環(huán)境保護和醫(yī)藥開發(fā)等［14-16］。我們從假單胞菌HC5發(fā)酵液對馬鈴薯晚疫病菌的抑制能力和HC5發(fā)酵液在不同溫度、pH以及紫外線照射時間下對馬鈴薯晚疫病菌抑制的穩(wěn)定性方面進行了研究，以期為菌株HC5在馬鈴薯晚疫病菌防治方面的應用推廣提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株HC5從土樣中分離篩選獲得。供試馬鈴薯晚疫病菌由甘肅省農業(yè)科學院植物保護研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基

試驗所用的培養(yǎng)基為黑麥西紅柿培養(yǎng)基（HX）：黑麥60 g、西紅柿汁100mL、碳酸鈣0.4 g、瓊脂15 g，加水至1 L。發(fā)酵用培養(yǎng)液為液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）：牛肉浸膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g，加水至1 L，pH 7.0。

1.3 菌株HC5對馬鈴薯晚疫病菌的拮抗測定

采用皿內涂布法、平板對峙法和胞外分泌物平板滲透法分別研究，并用抑菌率評價菌株HC5對馬鈴薯晚疫病菌的抑制能力。抑菌率=［（對照菌落半徑－處理菌落半徑）/對照菌落半徑］×100%。

1.3.1 皿內涂布法 將制備好的HC5菌株發(fā)酵菌液50 μL均勻涂布在直徑為9cm的HX平板中，隨后在平板中央接入直徑為0.5cm的馬鈴薯晚疫病菌餅，20℃左右黑暗培養(yǎng)10 d，測量病原菌的菌落半徑，計算抑菌率。取50 μL的無菌培養(yǎng)液涂布于HX平板中，接種病原菌塊為對照。試驗重復3次。

1.3.2 平板對峙法 在直徑為9cm的HX平板中心接種直徑為0.5cm的馬鈴薯病原菌餅，20℃左右黑暗培養(yǎng)7 d后，在距中央2.5cm處接入浸有菌株HC5發(fā)酵菌液、直徑為5mm的濾紙圓片，20℃左右黑暗繼續(xù)培養(yǎng)。設接種無菌培養(yǎng)液的處理為對照，試驗重復3次。10 d后測量病原菌的菌落半徑，計算抑菌率。

1.3.3 平板滲透法 將菌株HC5在液體NA培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)2～3d，180 r/min，28℃。發(fā)酵后的菌液離心去除菌絲，12 000 r/min，10min。取上清液，用0.22 μm無菌過濾器過濾，獲得胞外分泌物原液。將分泌物原液按1∶10的比例加入到HX培養(yǎng)基中，混勻制成平板。然后將直徑0.5cm的馬鈴薯病原菌餅接種于中央，20℃左右黑暗培養(yǎng)10d。設加入無菌培養(yǎng)液到HX培養(yǎng)基中制成的平板，接入病原菌餅的為對照，試驗重復3次。10 d后測量病原菌的菌落半徑，計算抑菌率。

1.4 菌株HC5對馬鈴薯晚疫病菌抑制穩(wěn)定性的測定

采用平板滲透法進行菌株HC5胞外分泌物對馬鈴薯晚疫病菌抑制作用穩(wěn)定性研究。設加入無菌培養(yǎng)液到培養(yǎng)基中制成的平板，接入病原菌餅的為對照1；加入不經過各項處理的胞外分泌物到培養(yǎng)基中制成的平板，接入病原菌餅的為對照2。

1.4.1 不同溫度處理后的抑制作用 將菌株HC5的胞外分泌物在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃溫度條件下分別處理10min、20min、30min后，加入培養(yǎng)基中進行試驗測定，每處理均重復3次。

1.4.2 不同pH處理后的抑制作用 將菌株HC5的胞外分泌物用1MNaOH或1MHCl調整到處理所需的pH：3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，分別處理2 h、3 h、4 h后，再用1MNaOH或1MHCl調整到pH為7.0，隨后加入培養(yǎng)基中進行試驗測定，每處理均重復3次。

1.4.3 紫外線處理后的抑制作用 將菌株HC5的胞外分泌物在紫外燈下20cm處照射30min、60min、90min、120min、150min后，加入培養(yǎng)基中進行試驗測定，每處理均重復3次。

2 結果與分析

2.1 菌株HC5對馬鈴薯晚疫病菌的拮抗效果

采用皿內涂布法、平板對峙法和胞外分泌物平板滲透法分別評價了菌株HC5對馬鈴薯晚疫病菌的抑制能力，結果顯示，菌株HC5對馬鈴薯晚疫病菌有很強的抑制作用。如圖1，接入菌株HC5后，馬鈴薯晚疫病原菌幾乎不生長，抑菌率基本都在100%。

圖1 不同方法菌株HC5對馬鈴薯晚疫病菌的抑制效果

2.2 菌株HC5對馬鈴薯晚疫病菌抑制的穩(wěn)定性

2.2.1 不同溫度處理對抑制作用的影響 如圖2所示，菌株HC5胞外分泌物在40℃和50℃下處理10min、20min、30min，對馬鈴薯晚疫病菌依然有較好的抑制作用，馬鈴薯晚疫病菌幾乎不生長；從60℃開始到100℃，對馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用就受到影響，不論是10min的短時間處理還是30min的長時間處理，均破壞了抑制作用，馬鈴薯晚疫病菌生長狀態(tài)和對照無差別。

2.2.2 不同pH處理對抑制作用的影響 如圖3所示，菌株HC5胞外分泌物在pH 5.0～11.0處理下，對馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用沒有影響，馬鈴薯晚疫病菌受到抑制，幾乎不生長；在pH 3.0處理下，對馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用有影響，破壞了抑制作用，馬鈴薯晚疫病菌生長正常。

圖2 不同溫度處理對抑制作用的影響

圖3 不同pH處理對抑制作用的影響

2.2.3 紫外線處理對抑制作用的影響 如圖4所示，菌株HC5胞外分泌物在紫外線下照射，不論是30min的短時間處理還是120min的長時間處理，對馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用均沒有影響，依然有較好的抑制作用，馬鈴薯晚疫病菌幾乎不生長。

圖4 紫外線處理對抑制作用的影響

3 小結與討論

為了豐富馬鈴薯晚疫病的生物防治資源數據庫，我們從土壤中分離篩選，獲得了對馬鈴薯晚疫病菌具有較強拮抗作用的假單胞菌HC5。采用皿內涂布法、平板對峙法和平板滲透法分別評價了HC5菌株發(fā)酵液對馬鈴薯晚疫病菌的抑制能力。結果顯示，不同方法下，菌株HC5發(fā)酵液對馬鈴薯晚疫病菌均具有較強的抑制作用。采用平板滲透法進一步研究了菌株HC5發(fā)酵液在不同溫度、pH以及紫外線照射時間對馬鈴薯晚疫病菌抑制的穩(wěn)定性，結果顯示，菌株HC5發(fā)酵液在溫度50℃以下，pH 5～11，紫外線照射120min均對馬鈴薯晚疫病菌具有抑制作用，表現出的耐受穩(wěn)定性較強，具有應用潛力。

國外對馬鈴薯晚疫病生物防治的研究較早。Filippov已將Pseudomonas putida和Bacillus subtilis應用于馬鈴薯晚疫病的防治中［17］。Jindal K等測試了從葉表面分離得到的6種真菌對P.infestans有抑制作用［18］。近年來，國內在生防菌防治晚疫病方面也有一些報道。中國農業(yè)科學院生物防治所楊懷文等［19］報道嗜線蟲致病桿菌發(fā)酵液對P.in－festans有一定的抑制作用；王樹桐［20-22］研究了88種中草藥的抑菌活性，并進一步研究了知母提取物對致病疫霉抑菌作用及抑菌機制；蔣繼志等［23-24］研究發(fā)現，8種真菌發(fā)酵液和大蒜、洋蔥、丁香等植物離體組織及其提取物對馬鈴薯晚疫病病菌也都有強烈抑制作用?？梢娢⑸锶阂呀浛梢宰鳛閷ふ液脱兄岂R鈴薯晚疫病生物拮抗制劑的重要資源。

本研究通過拮抗性實驗表明，HC5的發(fā)酵液中可能分泌有某些抗生素而抑制植物病原菌的生長，具體是什么物質還有待進一步研究。在本研究中，該菌表現具有較強的耐高溫和耐堿等特點，受環(huán)境的影響較小，防效比較穩(wěn)定，這一結果為后期將其應用于生物農藥研發(fā)奠定了一定基礎。

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