田 璐，李凌燕，王偉青，汪長鋼，肖海峻，潘 妍，金啟厚

(北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442)

甘薯，又名甜薯，屬薯蕷科薯蕷屬纏繞草質(zhì)藤本。其對土地要求不高，具有耐貧瘠、高產(chǎn)出、多用途糧食等特性，在我國主要糧食中產(chǎn)量僅次于水稻、小麥、玉米，位居第4位[1]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計資料，我國2009年甘薯產(chǎn)量為7 677.26萬t。其產(chǎn)量和面積均居全球榜首，是我國重要糧食資源之一。近些年隨著我國經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展，人們消費觀念的轉(zhuǎn)變，甘薯的保健及藥用價值越來越受關(guān)注，在甘薯產(chǎn)業(yè)上有重要的戰(zhàn)略意義。

糖蛋白是一種含有寡糖鏈的蛋白質(zhì)，兩者之間以共價鍵相連。其中的寡糖鏈通常是經(jīng)由共轉(zhuǎn)譯修飾或是后轉(zhuǎn)譯修飾過程中的糖基化作用而連結(jié)在蛋白質(zhì)上，其總體性質(zhì)更接近蛋白質(zhì)。糖蛋白具有調(diào)節(jié)免疫[2]、抑制腫瘤[3]、降低血糖和血脂、抗氧化、防衰老等作用。近年來研究認(rèn)為，甘薯所含黏蛋白，有助于保持心血管壁的彈性和防止動脈粥樣硬化[4]。因此甘薯糖蛋白提取有良好的前景[5]，對于甘薯糖蛋白的提取，目前數(shù)據(jù)不一，分析方法統(tǒng)計系統(tǒng)不一。故筆者采用水浸提取甘薯中糖蛋白，用醇沉法[6]將其沉淀，經(jīng)Sveage法[7]去雜蛋白后制得粗品。通過單因素試驗，再進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面法對提取過程中溫度、時間、料液比、超聲波功率4個因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化得出最優(yōu)工藝，給甘薯糖蛋白產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1原料和主要試劑。甘薯購于北京市大興區(qū)龐各莊鎮(zhèn)甘薯研究基地；牛血清白蛋白(標(biāo)準(zhǔn)品)、磷酸(分析純)、考馬斯亮藍(lán)G250，均由中國醫(yī)藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司提供；Sevage試劑(氯仿-正丁醇=4∶1)、95%乙醇、無水乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2主要儀器。HH-4電熱恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；雙光束紫外光可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；智能高速冷凍離心機(jī)，湖南郝西裝備有限公司；手提式細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；BSAZ245型電子天平，賽得利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；GZX-9070MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2方法

1.2.1甘薯糖蛋白的提取。甘薯糖蛋白的提取工藝流程如下[5]：新鮮甘薯→清洗去皮→切片→60 ℃干燥12 h→勻漿→水浸提→離心(10 000 r/min,10 min)→取上清液→無水乙醇(3倍體積)沉淀→離心(10 000 r/min,10 min)→收集沉淀→水溶解→Sevage法除雜蛋白→無水乙醇沉淀過夜→離心收集沉淀→低溫干燥→糖蛋白粗品。

1.2.2甘薯糖蛋白的測定和得率的計算。粗蛋白干品，加入25 mL水溶解后，搖勻取1 mL定容到10 mL，即稀釋250倍。取稀釋后溶液1 mL于試管中，加入已配制好的考馬斯亮藍(lán)G250染液5 mL，搖勻靜置10 min,在波長595 nm處測定吸光值，吸光值平均值對照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到蛋白質(zhì)量，然后乘以稀釋倍數(shù)(250)，即得到提取糖蛋白質(zhì)量(以蛋白質(zhì)質(zhì)量計)，算出得率(糖蛋白得率=糖蛋白粗品量/干粉量×100%)。

1.2.3蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)結(jié)晶牛血清蛋白100 mg，加水溶解定容至100 mL,配制成濃度為1 mg/mL的溶液。分別移取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL于試管中，加蒸餾水補(bǔ)齊至1 mL,加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G250搖勻，用1 cm的玻璃比色皿，在波長595 nm處測定各管溶液的吸收值，以A595 nm值(y)為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)實際質(zhì)量(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出線性回歸方程。

1.2.4甘薯糖蛋白提取單因素試驗。

1.2.4.1不同料液比對糖蛋白得率的影響。在提取時間為40 min、溫度50 ℃、功率200 W條件下，采用不同料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 (g∶mL)]進(jìn)行提取。計算粗蛋白在不同料液比下的得率，確定最佳的提取料液比。

1.2.4.2不同超聲波功率對糖蛋白得率的影響。在料液比為1∶20(g∶mL)、溫度50 ℃、時間40 min條件下，采用不同超聲波功率(100、200、300、400 W)進(jìn)行提取。計算粗蛋白在不同超聲波功率下的得率，確定最佳的提取功率。

1.2.4.3不同提取溫度對糖蛋白得率的影響。在料液比為1∶20(g∶mL)、超聲波功率200 W、時間40 min的條件下,采用不同提取溫度(40、50、60、70 ℃)進(jìn)行提取。計算粗蛋白在不同提取溫度下的得率，確定最佳的提取溫度。

1.2.4.4不同提取時間對糖蛋白得率的影響。在料液比為1∶20(g∶mL)、超聲波功率200 W、溫度為50 ℃的條件下,采用不同浸提取時間(40、60、80、100 min)進(jìn)行提取。計算在不同提取時間下的得率，確定最佳的提取時間。

1.2.5甘薯糖蛋白提取工藝優(yōu)化試驗。在單因素試驗研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計了4因素3水平的響應(yīng)面試驗，每個水平做3個平行試驗,對甘薯糖蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素水平

1.2.6驗證試驗。對甘薯糖蛋白提取工藝優(yōu)化的結(jié)果進(jìn)行重復(fù)試驗，以驗證工藝條件的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1紫外吸收法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制測定6個濃度的牛血清蛋白在波長為595 nm處的吸光值，以檢測的平均吸光值(A595 nm)為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)實際質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出線性回歸方程，見圖1。

圖1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Protein standard curve

2.2各因素對糖蛋白提取得率的影響

2.2.1料液比對甘薯糖蛋白得率的影響。料水比對提取率具有重要影響，單位量甘薯粉提取劑量越大，越有利于有效成分的擴(kuò)散，但水量過大會影響后期蒸發(fā)濃縮的工序。圖2表明，料液比1∶10～1∶20(g∶mL)其提取率上升較快，但到達(dá)1∶20(g∶mL)后，提取率較為恒定，故最優(yōu)值因存在于1∶10～1∶20(g∶mL)。

圖2 料液比對甘薯糖蛋白得率的影響Fig.2 The effect of solid-liquid ratio on the yield of glycoprotein

2.2.2溫度對甘薯糖蛋白得率的影響。如圖3所示，隨著溫度的上升，糖蛋白的提取率也緩慢上升，分析由于熱能轉(zhuǎn)化為內(nèi)能，使分子間運動加快，有效物質(zhì)更容易與溶劑接觸；但在50～60 ℃，提取率下降速度很快，說明由于溫度高于一定水平后，目的蛋白質(zhì)逐漸變性失活。故應(yīng)選取較低溫度處理，在40～60 ℃尋找最優(yōu)值。

圖3 溫度對甘薯糖蛋白得率的影響Fig.3 The effect of temperature on the yield of glycoprotein

2.2.3提取時間對甘薯糖蛋白得率的影響。由圖4可見，隨著時間的持續(xù)，提取率穩(wěn)定上升，在20～60 min增長趨勢高于60～80 min。分析由于初期有效物質(zhì)濃度較高，與溶劑接觸更為緊密，概率更高，而后期有效物質(zhì)濃度較低，提取率上升趨勢減緩。故選取最優(yōu)值應(yīng)存在于40～80 min。

圖4 提取時間對甘薯糖蛋白得率的影響Fig.4 The effect of extraction time on the yield of glycoprotein

2.2.4超聲波功率對甘薯糖蛋白得率的影響。由圖5所示，超聲波功率對糖蛋白得率影響較大，在100～200 W提取率呈上升趨勢，但300 W得率出現(xiàn)較大下降。分析由于超聲波的功率初期逐步上升，破壞細(xì)胞壁有益目的蛋白的釋放，但到達(dá)一定程度后超聲波的機(jī)械力對目的蛋白產(chǎn)生了破壞。故選取100～300 W進(jìn)行優(yōu)化。

圖5 超聲波功率對甘薯糖蛋白得率的影響Fig.5 The effect of ultrasonic power on the yield of glycoprotein

2.3響應(yīng)面試驗結(jié)果分析在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，進(jìn)行以料液比、超聲功率、溫度、時間為自變量，糖蛋白提取率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗，試驗結(jié)果見表2。

表2中試驗1～24為析因試驗,25～29為中心試驗，一共有29個試驗點分為析因點和零點，析因點為自變量取值在每個因素所構(gòu)成的三位頂點。中心試驗有5組，目的是估算誤差。

4個因素經(jīng)擬合得到的回歸方程如下：提取率 =0.69-0.033A+0.051B-0.17C-0.019D+0.013AB+0.073AC-0.13AD-7.500E-005BC-0.024BD-0.022CD-0.097A2-0.16B2+0.030C2+2.428E-003D2。

軟件Design-Expert.8.05b的ANOVA分析結(jié)果如下：FA=67.021 1，PA< 0.000 1；FB=153.010 7，PB<0.000 1；FC=1 804.545 5，PC<0.000 1；FD=30.444 1，PD<0.000 1；FAB=3.249 0，PAB=0.093 0；FAC=105.560 4，PAC<0.000 1；FAD=347.054 0，PAD< 0.000 1；FBC=0.000 1，PBC=0.991 7；FBD=11.536 1，PBD=0.004 3；FCD=23.172 1，PCD=0.000 3；FA2=294.856 3，PA2<0.000 1；FB2=837.825 6，PB2<0.000 1；FC2=20.164 6，PC2=0.000 5；FD2=0.172 4，PD2=0.684 2；F模型=264.611 4，P模型< 0.000 1；F失擬=3.800 4，P失擬=0.105 0。

由方差分析結(jié)果可看出，該回歸方程顯著，4個因素均極其顯著，同時AC、AD、A2、B2也對響應(yīng)值影響非常顯著，表明試驗因素對響應(yīng)值的關(guān)系不是簡單的線性關(guān)系，二次項和交互作用也具有一定影響。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

由圖6～8可直觀地看出，各因素間的交互作用及等值線分析圖，從響應(yīng)面最高點和等值線可看出，篩選范圍存在極值，即是響應(yīng)面的最高點，也是等值線的最小橢圓的中點。圖6可明顯看出相對于料液比，功率對響應(yīng)值即提取率的影響更大，可能是由于過大的功率，使超聲波對目的糖蛋白產(chǎn)生了破壞。由圖7可較為直觀地看出，溫度與料液比之間的交互作用對提取率的影響較大，兩因素分別選取較小值時，可以得到較大的提取率，分析可能由于溫度對蛋白的影響較大，溫度過高容易使蛋白變性，而只能保持相對較低的溫度，不能通過提高溫度來增加提取率，只能取相對小的料液比，才能獲得相對高溫帶來的目的蛋白與溶劑接觸概率持平。

圖6 功率與料液比對提取率的影響Fig.6 The effect of ultrasonic power and solid-liquid ratio on the extraction rate

圖7 溫度與料液比對提取率的影響Fig.7 The effect of temperature and solid-liquid ratio on the extraction rate

圖8也明顯表達(dá)了時間與料液比之間存在顯著的交互作用，當(dāng)時間和料液比取較大水平時導(dǎo)致提取率下降很大，可能是由于在蛋白含量相對較低的水平下，過久的時間對蛋白也會產(chǎn)生一定破壞。

Design-Expert.8.05b分析得出，甘薯糖蛋白的最佳提取條件為提取溫度40 ℃，時間80 min，功率205 W，料液比1∶20(g∶mL),此條件下糖蛋白粗品理論提取率為1.035 5%。

2.4驗證試驗結(jié)果在提取溫度40 ℃、時間80 min、功率205 W、料液比1∶20(g∶mL)的條件下重復(fù)試驗5次，甘薯糖蛋白得率分別為1.001 7%、1.012 3%、1.014 9%、1.027 8%、1.021 9%。由此表明重復(fù)試驗穩(wěn)定，平均甘薯糖蛋白得率達(dá)到1.015 72%，與理論值僅相差2%，說明此優(yōu)化具有實際應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

響應(yīng)面分析法在提取條件優(yōu)化過程中，可連續(xù)對影響因素的各個水平進(jìn)行分析，并在響應(yīng)因素與響應(yīng)值之前確立數(shù)學(xué)模型，通過對數(shù)據(jù)擬合得到較好的試驗參數(shù)。該試驗得到的優(yōu)化糖蛋白提取工藝為提取溫度40 ℃，時間80 min，功率205 W，料液比1∶20(g∶mL)，該條件下平均甘薯糖蛋白得率達(dá)到1.015 72%。

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