姚玥彤，王玉梅，侯梓園，王 斌，石雅峰，潘寶平，閆春財(cái)*

(1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；2.天津市北大港濕地自然保護(hù)區(qū)管理中心，天津 300270)

青蛤(Cyclinasinensis)是我國(guó)傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類[1]，它不僅肉質(zhì)鮮美，還具有極高的藥用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。但近年來(lái)，隨著不斷擴(kuò)大的增養(yǎng)殖規(guī)模、日益加深的集約化程度以及不斷惡化的養(yǎng)殖環(huán)境，青蛤的大規(guī)模病害和死亡現(xiàn)象日漸增多[2]。為了保證青蛤養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，更好地推動(dòng)我國(guó)沿海經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，青蛤免疫抗病害方面的研究迫在眉睫。

貝類屬于非特異性免疫系統(tǒng)，其中Toll樣受體是非特異性免疫反應(yīng)中一類重要的識(shí)別受體，在對(duì)抗病原物的侵染過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[3-8]。MAPK家族是TLRs信號(hào)通路中的重要成員之一，它作為介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的一種重要信號(hào)系統(tǒng)，參與了細(xì)胞間多種生化反應(yīng)信號(hào)的識(shí)別、傳遞以及放大等處理過(guò)程[9]。目前研究認(rèn)為MAPKs主要由細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2、氨基末端激酶、p38MAPK和ErK5這4條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)組成[10-12]。p38是MAPKs通路的主要蛋白之一，它的激活途徑很保守，屬于典型的3級(jí)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)磷酸化激活途徑[9]。目前對(duì)此通路的研究在脊椎類如人類[13]、小鼠[14]等中的報(bào)道較多，但在無(wú)脊椎動(dòng)物中的報(bào)道較少，因此對(duì)貝類免疫學(xué)的研究具有重要的理論意義。探究MAPK/p38在MAPKs信號(hào)通路中的作用，為探索絲裂原活化蛋白激酶所參與的青蛤免疫機(jī)制提供重要的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并為選育貝類新品種、開(kāi)發(fā)疫苗提供理論依據(jù)，減少其養(yǎng)殖過(guò)程中的大規(guī)模死亡現(xiàn)象，從而推動(dòng)沿海地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1材料在天津大港的灘涂區(qū)域采集青蛤后選取各形態(tài)指標(biāo)無(wú)顯著差異的有活性個(gè)體為試驗(yàn)對(duì)象，在海水密度為1.02～1.04 g/cm3，水溫為21～24 ℃，pH 7.0的通氣人工海水中暫養(yǎng)14 d左右[15]。暫養(yǎng)期間需要每天更換一次水且持續(xù)曝氣，并喂養(yǎng)一次0.005 g/mL的小球藻[16]。該試驗(yàn)所用的Poly：Ic低溫冷凍保存于天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)[17]。

1.2方法

1.2.1材料處理。飼養(yǎng)14 d后選取無(wú)明顯形態(tài)差異且表面無(wú)破損的青蛤進(jìn)行分組。試驗(yàn)之前將保存的Poly：Ic接種到2216E液體培養(yǎng)基中(比例1∶100)。將接好的菌種轉(zhuǎn)移進(jìn)搖床中培養(yǎng)1 d，控制溫度為37 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min，用無(wú)菌海水洗脫至OD600=0.4[17]。試驗(yàn)組每只青蛤注射50 μL Poly：Ic菌液，對(duì)照組中每只青蛤注射等量的滅菌生理鹽水。每個(gè)組別采用隨機(jī)分組的方法設(shè)置10個(gè)平行組。在注射0、3、6、12、24、48、96 h后分別提取青蛤的血淋巴冷凍備用。

1.2.2青蛤轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建。TRIZOL法提取青蛤各個(gè)組織的總RNA，用RNA提取試劑盒分離mRNA。采用第二代MiSeq測(cè)序儀，pair end雙端模式完成青蛤轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，利用De novo RNA-seq analysis技術(shù)綜合分析，分析相關(guān)基因功能注釋和代謝途徑，后通過(guò)篩選得到MAPK/p38基因的類似序列。

1.2.3MAPK/p38基因結(jié)構(gòu)域的克隆及生物信息學(xué)分析。利用獲得的MAPK/p38基因類似序列設(shè)計(jì)克隆引物MAPK/p38-S：5′-CCAATGTCTTAGCCCGGTAGG-3′，MAPK/p38-A：5′-GTAAGGGTGTGCAAGAGCC-3′，進(jìn)行克隆，與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blastx比對(duì)，并完成系統(tǒng)樹(shù)的建立。

1.2.4Poly：Ic刺激下青蛤MAPK/p38基因在血淋巴內(nèi)的時(shí)序性表達(dá)。按照上述材料中的方法處理青蛤，并分別在0、3、6、12、24、48、96 h時(shí)提取Poly：Ic試驗(yàn)組和對(duì)照組青蛤血淋巴的總RNA后，將其反轉(zhuǎn)成cDNA(TRIZOL法)，保存在-20 ℃條件下[18]。

以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量，β-actin-S：5′-CACCACAACTGCCGAGAG-3′，β-actin-A：5′-C-CGATAGTGATGACCTGACC-3′；MAPK/p38-S：5′-CCAATGTCTTAGCCCGGTAGG-3′，MAPK/p38-A：5′-GTAAGGGTGTGCAAGAGCC-3′，上述為所用引物[15]。

Rotor-Gene 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀為反應(yīng)儀器。擴(kuò)增體系共20 μL，其反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[16]。

1.2.5Poly:Ic刺激后青蛤不同組織中的表達(dá)特征。在Poly:Ic刺激后用TRIZOL法提取青蛤血淋巴、閉殼肌、外套膜、肝臟和鰓的總RNA，之后反轉(zhuǎn)成cDNA，-20 ℃保存。內(nèi)參基因、實(shí)時(shí)定量時(shí)所用的引物序列、體系和程序、數(shù)據(jù)處理方法同“1.2.4”。

2 結(jié)果與分析

2.1青蛤MAPK/p38基因的生物信息學(xué)分析分析顯示MAPK/p38基因無(wú)跨膜區(qū)，為完整的胞內(nèi)蛋白；其信息傳遞序列位于第30～40個(gè)氨基酸；有一個(gè)完整的激酶結(jié)構(gòu)域：S-TKc，位于第27～311個(gè)氨基酸；建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)，青蛤的MAPK/p38基因與光滑雙臍螺的親緣關(guān)系最近。

圖1 青蛤MAPK/p38基因和其他物種的MAPK/p38基因氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)Fig.1 The phylogenetic tree constructed by the amino acid sequence of MAPK/p38 from C. sinensis and MAPK/p38 from other species

2.2青蛤MAPK/p38基因結(jié)構(gòu)域的克隆用“1.2.3”中的引物，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到青蛤MAPK/p38基因的結(jié)構(gòu)域序列(圖2)，結(jié)構(gòu)域序列長(zhǎng)855 bp。擴(kuò)增體系為25 μL，其反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。

圖2 青蛤MAPK/p38基因結(jié)構(gòu)域的克隆結(jié)果Fig.2 Cloning result of genetic structure domain of MAPK/p38 from C. sinensis

2.3青蛤MAPK/p38基因在不同組織間的表達(dá)以β-actin基因在各組織中的表達(dá)量為內(nèi)參對(duì)照，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析MAPK/p38基因在青蛤剛剛注射Poly：Ic后其血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌和鰓5個(gè)組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明該基因在以上組織中普遍表達(dá)(圖3)，但表達(dá)量有明顯不同，在血淋巴中表達(dá)量最高，與其他組織相比差異極顯著(P<0.01)，鰓中表達(dá)量最少。

圖3 MAPK/p38基因在青蛤不同組織中的表達(dá)分布Fig.3 The distribution of MAPK/p38 expression in different tissues of C.sinensis

2.4Poly：Ic刺激下青蛤MAPK/p38基因在血淋巴中的時(shí)序性表達(dá)以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，用實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)分析被Poly：Ic侵染后的青蛤MAPK/p38基因在血淋巴中表達(dá)的時(shí)序性變化。結(jié)果表明：表達(dá)量達(dá)到最大值時(shí)為刺激3 h后，與對(duì)照組相比存在極顯著差異(P<0.01)，之后的數(shù)值逐漸下降，最后趨于正常水平(圖4)。

圖4 Poly：Ic刺激下青蛤MAPK/p38基因在血淋巴中的時(shí)序性表達(dá)結(jié)果Fig.4 The temporal expression of MAPK/p38 gene in hemolymph was stimulated by the Poly：Ic

3 討論

該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Poly：Ic刺激過(guò)后的試驗(yàn)組中，目的基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)，其中在血淋巴中表達(dá)量最高，在鰓中的表達(dá)量最低。這與未刺激時(shí)目的基因在各個(gè)組織中表達(dá)的相對(duì)含量一致；在隨后的時(shí)序性表達(dá)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Poly：Ic刺激后的96 h中血淋巴內(nèi)的表達(dá)量呈先升高后又逐漸減少直至趨于正常水平的趨勢(shì)，在刺激3 h后達(dá)到表達(dá)的最高值且與對(duì)照組的差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與刺激其他動(dòng)物的結(jié)果相吻合：長(zhǎng)牡蠣和蠶的defenfe經(jīng)刺激后血淋巴的表達(dá)量明顯上升并在刺激6 h后達(dá)到最高值[19-20]，蝦夷扇貝的TOllip和NF-κB基因在刺激3 h后表達(dá)量顯著上升，而且MKK和TNFR基因的表達(dá)水平也有變化[21-24]。青蛤血淋巴中MAPK/p38基因在刺激后大量表達(dá)這一現(xiàn)象，能揭示該基因的表達(dá)產(chǎn)物可能承擔(dān)著青蛤?qū)τ诜烙?xì)菌感染等免疫應(yīng)答方面的特殊作用。同時(shí)，由于表達(dá)結(jié)果所得數(shù)據(jù)與其他微生物刺激后的表達(dá)量具有差異性，得知青蛤MAPK/p38基因在不同刺激下的免疫應(yīng)答反應(yīng)進(jìn)程是不同的，并且發(fā)現(xiàn)在Poly：Ic菌液刺激下的免疫應(yīng)答程度更顯著。后續(xù)可以從以上方面入手進(jìn)一步研究。

青蛤受到外界因素脅迫后，其血淋巴中MAPK/p38基因表達(dá)在較短時(shí)間內(nèi)至最大值，說(shuō)明病原物能夠識(shí)別并誘導(dǎo)TLRs免疫受體及下游MAPK/p38信號(hào)通路蛋白，而后使其血液中合成相應(yīng)的免疫信號(hào)蛋白，防止機(jī)體自身受到外來(lái)脅迫物的侵害。同時(shí)，MAPK/p38基因的表達(dá)量大體上呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，證明MAPK/p38基因參與了非特異免疫的全部過(guò)程。該試驗(yàn)結(jié)果為探索絲裂原活化蛋白激酶所參與的青蛤免疫機(jī)制提供了重要的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并為選育貝類新品種、開(kāi)發(fā)疫苗提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

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