劉 影，謝為天，吳 娟，徐春厚

(廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東湛江 524088)

海洋紅酵母是指存在于海洋環(huán)境及海洋生物中的單細(xì)胞真核微生物。國(guó)外研究表明，在深海火山以及一些受污染海域、太平洋、印度西南海岸、南極等不同的海域中，紅酵母均為優(yōu)勢(shì)菌群[1-5]。海洋紅酵母富含蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸、類(lèi)胡蘿卜素、蝦青素、消化酶、維生素、核苷酸等，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和活性作用，可作為食品添加劑、功能生物飼料、抗氧化劑、微生物拮抗劑及著色劑等應(yīng)用[6-10]。

海洋紅酵母作為微生態(tài)制劑應(yīng)用時(shí)，能顯著提高水產(chǎn)動(dòng)物幼苗的存活率，提高飼料效果和飼料報(bào)酬，并能增強(qiáng)動(dòng)物體的免疫功能，減少抗生素用量，是生態(tài)養(yǎng)殖的優(yōu)良添加劑[11]。攝食添加海洋紅酵母飼料的水產(chǎn)動(dòng)物具有抗病能力強(qiáng)、存活率高、皮膚和肌肉色澤鮮艷、口味好等特點(diǎn)[12]。在海洋紅酵母中，膠紅酵母和粘紅酵母是南海近岸海域的優(yōu)勢(shì)種群[6,13]，含有類(lèi)胡蘿卜素、蝦青素、消化酶、維生素等活性物質(zhì)，是具有較高開(kāi)發(fā)價(jià)值的益生菌株[6]。筆者選用的膠紅酵母J6-82和粘紅酵母J2-75是從雷州半島近岸海域分離鑒定和誘變選育的2株海洋紅酵母突變菌株，具有營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、繁殖速度快、易培養(yǎng)、類(lèi)胡蘿卜素和蝦青素產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的開(kāi)發(fā)前景，故有必要對(duì)其進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，以期為今后將其作為益生菌株的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌株膠紅酵母J6-82和粘紅酵母J2-75，由廣東海洋大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定、誘變選育和保存。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物42只SPF級(jí)昆明(KM)小鼠，體質(zhì)量為28～30 g，購(gòu)于廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3培養(yǎng)基

1.3.1紅酵母培養(yǎng)基。蛋白胨 20 g/L，酵母膏 10 g/L，葡萄糖 20 g/L，NaCl 20 g/L，pH自然。

1.3.2紅酵母瓊脂培養(yǎng)基。在紅酵母培養(yǎng)基中加入瓊脂粉 20 g/L，pH自然。

1.42株紅酵母菌懸液的制備分別將膠紅酵母J6-82和粘紅酵母J2-75劃線接種于紅酵母瓊脂培養(yǎng)基平板，28 ℃下培養(yǎng)72 h，用滅菌生理鹽水刮下紅酵母菌苔，置于帶玻璃珠的三角瓶中振蕩，用滅菌紗布過(guò)濾；使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)紅酵母的菌體細(xì)胞數(shù)量，配制成細(xì)菌數(shù)量分別為1×107、1×109和1×1011個(gè)/mL的菌懸液。

1.5毒性試驗(yàn)

1.5.1動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)。將42只小鼠隨機(jī)分成7組，分別為試驗(yàn)組(①、②、③、④、⑤、⑥)和對(duì)照組，每組6只，公母各半，逐只稱(chēng)重；試驗(yàn)組①、②、③小鼠灌服膠紅酵母J6-82菌懸液，細(xì)菌數(shù)量分別1×107、1×109和1×1011個(gè)/mL；試驗(yàn)組④、⑤、⑥小鼠灌服粘紅酵母J2-75菌懸液，細(xì)菌數(shù)量分別為1×107、1×109和1×1011個(gè)/mL；對(duì)照組小鼠灌服滅菌的紅酵母培養(yǎng)基；試驗(yàn)小鼠連續(xù)灌服14 d，每天1次，0.5 mL/只；灌服前后分別禁食8和2 h，不禁水，每天對(duì)小鼠進(jìn)行稱(chēng)重和一般性觀察；第15天，對(duì)小鼠進(jìn)行血常規(guī)測(cè)定、臟器指數(shù)測(cè)定、病理解剖學(xué)觀察及肝臟組織切片觀察。

1.5.2測(cè)定項(xiàng)目與方法。試驗(yàn)開(kāi)始后，每天上午、下午各觀察1次，詳細(xì)記錄小鼠的外觀體征、采食飲水、中毒癥狀及死亡情況；小鼠在每天灌胃前逐只稱(chēng)重，記錄重量；詳細(xì)記錄每組小鼠的飲水量。

(1)小鼠血常規(guī)測(cè)定。試驗(yàn)開(kāi)始后的第15天(提前12 h禁食)，每組隨機(jī)取3只小鼠，摘眼球取血，將血液滴入裝有EDTAIC2抗凝劑的真空采血管中，取血樣約100 μL，使用BC-3000全自動(dòng)三分群血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血常規(guī)分析檢測(cè)。

(2)小鼠病理解剖學(xué)觀察及臟器指數(shù)測(cè)定。試驗(yàn)開(kāi)始后的第15天(提前12 h禁食)，每組取3只小鼠，脫頸椎處死小鼠并將其解剖，觀察有無(wú)病變器官，剝離心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等脂肪和筋膜后稱(chēng)重，用于測(cè)定小鼠臟器指數(shù)。

(3)小鼠病理組織學(xué)觀察。將用于小鼠血常規(guī)測(cè)定的14只(每組取2只)小鼠的肝臟制成病理組織切片，用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.6數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析，差異顯著時(shí)進(jìn)行Duncan’s多重極差比較，P<0.05表示差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1小鼠一般體征的觀察將2株紅酵母的菌懸液分別按3個(gè)不同濃度灌服小鼠，連續(xù)觀察14 d，發(fā)現(xiàn)所有小鼠均表現(xiàn)為健康活潑的正常狀態(tài)，采食和飲水正常，無(wú)發(fā)病和死亡現(xiàn)象。

2.2小鼠體質(zhì)量的變化由表1可知，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組小鼠平均體質(zhì)量呈增加趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)，各試驗(yàn)組間小鼠平均體質(zhì)量亦無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表1 各組小鼠平均體質(zhì)量的變化

2.3小鼠飲水量的變化從圖1可以看出，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組小鼠的飲水量略有下降，但差異不顯著(P>0.05)；各試驗(yàn)組間飲水量亦無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖1 各組小鼠平均飲水量的比較Fig.1 The comparison of the average amount of drinking water of mice among different groups

2.4小鼠血常規(guī)測(cè)定結(jié)果由表2可知，各試驗(yàn)組小鼠的淋巴細(xì)胞比率和淋巴細(xì)胞總數(shù)均高于對(duì)照組，且存在顯著差異(P<0.05)；粘紅酵母菌J2-75的淋巴細(xì)胞比率和淋巴細(xì)胞總數(shù)均高于膠紅酵母J6-82，且隨著灌服菌數(shù)的增多呈增加的趨勢(shì)。

2.5小鼠病理解剖學(xué)觀察及臟器指數(shù)測(cè)定結(jié)果每組取3只小鼠進(jìn)行解剖，肉眼觀察各組小鼠主要臟器的形態(tài)、顏色、質(zhì)地、充出血等，均未出現(xiàn)異常變化。由表3和表4可知，各試驗(yàn)組小鼠的臟器指數(shù)與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，各組小鼠的臟器指數(shù)均在正常值范圍內(nèi)。

2.6小鼠病理組織學(xué)觀察顯微鏡觀察小鼠的肝組織切片，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，各試驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)一樣，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，中央靜脈及其周?chē)派錉钆帕械母渭?xì)胞間緊密聯(lián)系，并且彼此連接成網(wǎng)狀，核仁明顯，胞質(zhì)均勻。

表2 各組小鼠淋巴細(xì)胞比率和淋巴細(xì)胞總數(shù)的比較

表3 膠紅酵母J6-82對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響(n=3)

注：(a).試驗(yàn)組①；(b).試驗(yàn)組②； (c).試驗(yàn)組③；(d).試驗(yàn)組④；(e).試驗(yàn)組⑤；(f).試驗(yàn)組⑥；(g).對(duì)照組Note：(a).test group ①;(b).test group ②;(c).test group ③;(d).test group ④;(e).test group ⑤; (f).test group ⑥;(g).control group 圖2 各組小鼠肝組織切片觀察(400×) Fig.2 The observation of liver tissue of mice in each group(400×)

表4 粘紅酵母J2-75對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響(n=3)

3 討論

在小鼠毒性試驗(yàn)中，將3個(gè)不同濃度的膠紅酵母J6-82和粘紅酵母J2-75菌懸液灌服小鼠，連續(xù)灌服14 d。在此期間，各試驗(yàn)組小鼠均呈健康活潑狀態(tài)，無(wú)發(fā)病、死亡現(xiàn)象，體質(zhì)量變化和飲水量正常，無(wú)病理解剖學(xué)變化；各試驗(yàn)組小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟指數(shù)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明2株紅酵母對(duì)小鼠無(wú)急性毒副作用；各試驗(yàn)組小鼠的淋巴細(xì)胞比率和淋巴細(xì)胞總數(shù)均顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明這2株紅酵母能夠增強(qiáng)小鼠機(jī)體的免疫力，且粘紅酵母菌J2-75具有更強(qiáng)的提高免疫力的作用。

徐占利等[14]用篩選出的膠紅酵母菌株進(jìn)行了急性毒性及遺傳性毒性研究，采用急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)及小鼠精子畸形試驗(yàn)對(duì)膠紅酵母進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明膠紅酵母菌屬于安全無(wú)毒性，并且未見(jiàn)其遺傳毒性。該試驗(yàn)結(jié)果亦證實(shí)了膠紅酵母J6-82和粘紅酵母J2-75突變菌株對(duì)小鼠無(wú)急性毒性，至于是否有遺傳性毒性尚有待于進(jìn)一步研究。

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