周佳，成長玉，郭慶，陳祥貴

（1.四川省食品藥品檢驗檢測院，四川成都 611731；2.西華大學食品與生物工程學院，四川成都610039）

氨基甲酸甲酯（Methy Carbamate，MC）及氨基甲酸乙酯（Ehthy Carbamate，EC）是在食品發(fā)酵過程中產生的一種發(fā)酵副產物，廣泛存在于發(fā)酵食品和酒精飲料中[1-3]。早在上世紀六七十年代，就已經證實兩種化合物均能誘發(fā)良性或惡性腫瘤，特別是肺癌和肝癌[4]，到近二十年有可信數據顯示，其在一般食品中含量較低，而發(fā)酵食品中含量較高。國際癌癥研究機構（International Agency for Research on cancer，IARC）已將氨基甲酸乙酯認定為2A級致癌物[5]，鑒于其對人類具有潛在的致癌性，氨基甲酸乙酯含量已成為近年來國際社會高度關注的食品安全熱點問題之一。特別是隨著居民生活水平提高，對發(fā)酵食品消費量不斷增加，氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯對健康可能存在一定安全隱患?，F行國家食品標準GB 5009.223-2014《食品安全國家標準食品中氨基甲酸乙酯的測定》[6]中對氨基甲酸乙酯含量測定的方法，只適用于液體基質，沒有對固體基質的測定方法，并且方法采用GC-MS的選擇離子監(jiān)測模式（Selected Ion Monitoring，SIM），干擾很大，腐乳、豆豉等復雜基質用GC-MS（SIM模式）常常無法定性。另一方面，氨基甲酸甲酯的測定在行業(yè)檢驗標準中是一片空白，查閱文獻，雖然被廣泛承認其對人體的危害性，但現階段只看到少量報道用液相或氣相-質譜（SIM模式）測定白酒中的氨基甲酸甲酯[7-8]，對其他發(fā)酵食品中氨基甲酸甲酯含量測定方法則未見報道。我國目前還未明確MC及EC在食品中的限量，制定穩(wěn)定的檢測方法很有必要，方便了解我國發(fā)酵食品中MC及EC的含量水平，為制定相應的限量提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

腐乳、豆豉、發(fā)酵乳、料酒、醬油、醋、白酒：市售。

1.2 主要儀器

Agilent 7890A/7000b GC-MS/MS三重四級桿氣相色譜串聯(lián)質譜儀：安捷倫科技有限公司；Sartorius CPA225D電子天平；德國賽多利斯茵泰科公司；Milli-Q超純水儀；美國Millipore公司；AS10200A型超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司。

1.3 試劑

甲醇：Merck公司；乙酸乙酯、乙醚、正己烷、氯化鈉：成都市科隆化工試劑廠；硅藻土固相萃取柱（1 000 mg/6 mL及2 000 mg/12 mL）：天津博納艾科技有限公司。

1.4 標準品

氨基甲酸乙酯：Dr.Ehrenstorfer GmbH；氨基甲酸甲酯：北京百靈威科技有限公司；D5-氨基甲酸乙酯：CDN ISOTOPES。

2 方法

2.1 標準中間液的配制

2.1.1 目標物使用液的配制

精密稱定氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯對照品適量，分別置棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至各量瓶中，得單一對照品儲備液。精密量取氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯儲備液適量，用甲醇配制成混合對照品中間液。（氨基甲酸甲酯濃度為2.0 μg/mL、氨基甲酸乙酯濃度為 1.0 μg/mL）。

2.1.2 內標使用液的配制

精密稱定D5-氨基甲酸乙酯對照品適量，置棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容置容量瓶中，得內標儲備液。精密量取D5-氨基甲酸乙酯內標儲備液適量，用甲醇配制成約2 μg/mL內標中間液。

2.1.3 基質空白標準溶液

將經過測定不含有被測目標物的同基質物質作為空白樣品，照樣品前處理項下（不加內標使用液）制備空白樣品基質溶液。精密吸取適量混合對照品中間液，各加入內標中間液100 μL，40℃以下氮吹至近干，加入空白樣品基質溶液各1 mL，制成基質標準使用液。

2.2 樣品前處理

2.2.1 液體基質

液體基質（包括料酒、醬油、醋、白酒）樣品搖勻，稱取 1 g（精確至 0.001 g）樣品，加入 100 μL 內標中間液（約 2 μg/mL），加入氯化鈉 0.3 g（醬油可不加），渦旋混勻，超聲5 min，使溶解，混勻，將樣品全部轉移至SPE小柱（Agela cleanert SLE-SPE，1 000 mg/6 mL）上，靜置10 min，用10 mL正己烷淋洗后，用10 mL乙醚-乙酸乙酯（95∶5）洗脫，收集洗脫液，洗脫液40℃以下氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，制成供試液。

2.2.2 固體基質

固體及半固體基質（腐乳、豆豉、發(fā)酵乳）樣品混勻（腐乳需用研缽研成糊狀），稱取5 g（精確至0.001 g）樣品，加入 500 μL 內標中間液（約 2 μg/mL）、氯化鈉1.0 g，精密加入超純水10 mL，渦旋混勻，超聲20 min，使充分混勻，離心，濾過，精密量取濾液2 mL至SPE（Agela cleanert SLE-SPE，2 000 mg/12 mL）上，靜置10 min，用20 mL正己烷淋洗后，用20 mL乙醚-乙酸乙酯（95∶5，體積比）洗脫，收集洗脫液40℃以下氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，制成供試液。

2.3 色譜質譜條件

2.3.1 色譜條件

色譜柱：毛細管色譜柱，DB-INNOWAX，30 m×0.25 mm（內徑）×0.25 μm（膜厚）；進樣口溫度：220℃；進樣方式：脈沖不分流；進樣量：1 μL；柱溫：80 ℃保持2 min，以10℃/min至180℃保持3 min，240℃后運行6 min；流速 1.0 mL/min。

2.3.2 質譜條件

載氣：氦氣；碰撞氣：氮氣；離子源：電子轟擊離子源（EI）；電子能量：70 eV，四級桿溫度：150℃；離子源溫度：230℃；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）方式；溶劑延遲：6.5 min。檢測化合物離子參數見表1，對照品及樣品（腐乳）總離子流圖見圖1，各化合物提取離子流圖見圖2。

表1 檢測化合物離子參數Table 1 Ion parameters of target compound

圖1 氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯對照品及樣品（腐乳）總離子圖Fig.1 Total ion chromatograms of methyl carbamate and ethyl carbamate

圖2 各化合物提取離子流圖Fig.2 Ion flow diagrams of various compounds

2.4 線性關系及檢測下限考察

取“2.1”項下混合對照品中間液適量，用甲醇稀釋成系列混合對照品溶液（每個化合物至少測定5個濃度水平），照上述方法進行測定，記錄峰面積，以對照品濃度（ng/mL）為橫坐標，以相應的峰面積為縱坐標，進行線性回歸，計算回歸方程。同時以信噪比（S/N）為3∶1及10∶1為基準分別測定各化合物的檢出限及定量限，結果見表2。

表2 MC及EC的回歸方程、線性范圍、檢出限、定量限Table 2 Regression equaion，linear ranges，limit of detection and limit of quantitation of the determination method for methyl carbamate and ethyl carbamate

結果表明各化合物在濃度范圍內線性關系良好，氨基甲酸甲酯檢出限在6 ng/mL，線性范圍為20 ng/mL～1 000 ng/mL，氨基甲酸乙酯檢出限在3ng/mL，線性范圍為 10 ng/mL～500 ng/mL。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取“2.2”項下制備的供試品溶液，室溫放置，分別在0、2、4、8、12、48h進樣測定，記錄其峰面積。結果各時間段氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯峰面積的RSD%分別為3.01%、0.57%，表明供試品在48 h內穩(wěn)定。

2.6 加標回收試驗

2.6.1 液體基質加標回收試驗

精密稱取已測定含量的樣品（共9份，分別精密加入低、中、高3個水平的混合對照品中間液，每份濃度3份），加入內標中間液 100 μL，按“2.2.1”項下制備加標回收率測定樣品溶液，進樣測定，內標法計算各化合物的平均回收率，結果見表3。

表3 MC及EC在液體基質中（料酒）的加標回收試驗結果（n=3）Table 3 The results of recovery experiment for methyl carbamate and ethyl carbamate in fluid matrix（n=3）

氨基甲酸甲酯回收率在75.83%～80.31%，RSD%小于3.04%，氨基甲酸乙酯回收率在99.80%～100.52%，RSD%小于2.03%，表明準確度良好。

2.6.2 固體基質加標回收試驗

精密稱取用研缽研成糊狀的樣品（腐乳共9份，分別精密加入低、中、高3個水平的混合對照品溶液，每份濃度 3 份），加入內標中間液 500 μL，按“2.2.2”項下制備加標回收率測定樣品溶液，進樣測定，內標法計算各化合物的平均回收率，結果見表4。

表4 MC及EC在固體半固體基質中（腐乳）的加標回收試驗結果（n=3）Table 4 The results of recovery experiment for methyl carbamate and ethyl carbamate in solid and semisolid matrix（n=3）

氨基甲酸甲酯回收率在60.28%～65.72%，RSD%小于3.22%，氨基甲酸乙酯回收率在99.86%～101.34%，RSD%小于2.44%，表明準確度良好。

2.7 各類食品中氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯含量

取各樣品（液體基質約1.0 g，固體基質約5.0 g），精密稱定，液體基質按“2.2.1”項下供試品溶液方法制備，固體基質按“2.2.2”項下供試品溶液方法制備，進樣測定，以D5-氨基甲酸乙酯為內標計算含量，結果見表5。

表5 各類發(fā)酵食物中氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯含量Table 5 The content of methyl carbamate and ethyl carbamate in various types of fermented food

3 結論

1）現行國家標準中只有針對液體基質中氨基甲酸乙酯的測定方法，沒有針對如腐乳、豆豉、酸奶這種固體及半固體基質的方法，本文建立了固體及半固體基質的前處理方法。

2）氨基甲酸甲酯（MC）及氨基甲酸乙酯（EC）均屬于微量檢測，由于其分子量均較?。∕C：75；EC：89），碎片離子易被干擾，文獻報道中測定氨基甲酸乙酯方法多使用GC-MS（SIM模式），單四級桿氣質聯(lián)用法[9-10]，常常無法定性，復雜的基質（如腐乳、豆豉）表現得尤為突出，腐乳中氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯干擾圖見圖3、圖4；本法采用GC-MS/MS（MRM模式）可以有效減少雜質的干擾，提高靈敏度。

圖3 腐乳基質中氨基甲酸甲酯SIM模式及MRM模式對比圖Fig.3 The comparison chart of SIM mode with MRM mode used determing methyl carbamate in fermented bean curd

圖4 腐乳基質中氨基甲酸乙酯SIM模式及MRM模式對比圖Fig.4 The comparison chart of SIM mode with MRM mode used determing ethyl carbamate in fermented bean curd

3）氨基甲酸乙酯（EC）為多位點致癌物，其危害性已得到國內外廣泛關注，其相關文獻報告較多，氨基甲酸甲酯（MC）與氨基甲酸乙酯（EC）一樣，同為食品發(fā)酵副產物，現今鮮少被報告，發(fā)酵食品中MC殘留的多少，尚待進一步調查和分析，本文首次建立GC-MS/MS內標法測定不同基質中同時測定氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯含量的方法，對關注食品安全與人體健康有極其重要的意義。

4）此方法關鍵步驟是收集洗脫液后氮吹，考察樣品分別用 20、30、40、50、60 ℃氮吹，結果發(fā)現在 40 ℃以下氮吹峰面積較穩(wěn)定（見圖5）；雖然本文采用內標法，峰面積有一定損失也可以對含量進行校正，但若樣品含量較低時，氮吹溫度過高，樣品將檢測不到含量，影響較大，綜合考慮以后選擇40℃以下氮吹。

圖5 氮吹溫度考察Fig.5 Investigation of the nitrogen blowing temperation

5）洗脫液含95%的乙醚，很容易便被吹干，如若吹干，將測量不到樣品中氨基甲酸乙酯及氨基甲酸甲酯的含量，因此，此試驗切忌不能將樣品吹干，否則無法檢測到樣品中氨基甲酸甲酯及氨基甲酸乙酯的含量。

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