王一，向勇平，劉丹丹，劉理金，姜偉，李錦毅

腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSC)是存在于腫瘤中的一小群特質細胞[1]，既有類似干細胞的自我更新、增殖、分化特性，同時有強致瘤能力[2-3]。1997年Bonnet等[4]首次在急性髓性白血病中發(fā)現CSC，隨后實體瘤乳腺癌、神經系統腫瘤、結腸癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌等中也陸續(xù)發(fā)現了CSC[5]。乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)是一種催化細胞內乙醛氧化為乙酸、催化視黃醇氧化為視黃酸的細胞溶質酶。研究發(fā)現，高表達ALDH1是CSC及正常干細胞的共同特征[6-7]。二甲雙胍(metformin，Met)是治療2型糖尿病的傳統口服藥物，研究發(fā)現其可影響腫瘤細胞的代謝及上皮間質轉化，具有抗腫瘤作用[8-10]。本研究通過ALDH標志物分選胃癌干細胞，并進一步探討Met對CSC的抑制作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和設備 細胞系MKN45由中國協和醫(yī)科大學細胞中心提供。實驗動物為BALB/c-nu小鼠，雌性，4周齡，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所。主要試劑：RPMI 1640、DMEM/F12培養(yǎng)基、無血清添加劑N2、B27購自美國Gibco公司，重組人表皮細胞生長因子(recombinant human epidermal growth factor，EGF)、重組人堿性成纖維生長因子(recombinant human basic fibroblast growth factor，bFGF)購自美國PeproTech公司，胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司，胰酶、四甲基偶氮唑鹽(methabenzthiazuron，MTT)、焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)購自美國Amresco公司，青霉素、鏈霉素購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國Sigma公司，結晶紫購自上海碧云天生物技術有限公司，ALDEFLUOR?干細胞鑒定試劑盒購自加拿大Stem Cell公司。普通和倒置光學顯微鏡購自日本Nikon公司，酶聯免疫檢測儀購自美國BioRad公司，流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 ALDH+CSC細胞鑒定

1.2.1.1 細胞培養(yǎng)及ALDH+細胞分選 將人胃癌細胞系MKN45用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，0.25%胰酶消化后傳代。選取對數生長期細胞，制備濃度為1×106個/ml的單細胞懸液。標記一個實驗管和一個對照管

實驗管：在細胞中加入活化的ALDEFLUOR?試劑5μl/ml，由于ALDH能將氟硼二吡咯氨基乙醛(BAAA)轉化為綠色發(fā)光物氟硼二吡咯甘氨酸(BAA)，所以通過專用通道分選帶綠色熒光BAA的細胞，即為ALDH+細胞[11]。

對照管：作為陰性對照組。加入十二烷基三乙基溴化銨(DEAB) 5μl/ml，由于特殊抑制劑DEAB能抑制ALDH的作用，所以可抑制BAAA轉化為BAA，故分選出ALDH–細胞。反應30min后，250×g離心5min，棄上清，用ALDEFLUOR?緩沖液重懸，用流式細胞儀檢測，檢測前加入碘化丙啶(PI)染色標記死亡細胞。

1.2.1.2 自我更新能力實驗 分選得到的ALDH+和ALDH–細胞分別用PBS清洗2次，懸浮于CSC培養(yǎng)基，調整細胞濃度為5000個/ml，每孔200μl接種于96孔板，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。分別于1、2、3、4、5、6、7、8d(以24h作為1d)時采用MTT法檢測細胞在570nm處的光密度(OD)值，并繪制生長曲線。

1.2.1.3 分化能力實驗 將MKN45親本細胞及分選所得ALDH+細胞和ALDH–細胞以5×104個/ml接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1周后用流式細胞儀檢測MKN45親本細胞、ALDH+細胞和ALDH–細胞中ALDH+細胞所占比例。

1.2.1.4 致瘤實驗 將ALDH+和ALDH–細胞懸浮于PBS與基質膠(1:1)混合液中，分為ALDH+細胞組和ALDH–細胞組，每組接種5×104個細胞于BALB/c-nu小鼠皮下，每組接種6只小鼠，觀察出瘤情況，測量瘤體長短徑，記錄瘤體出現的和間及個數。瘤體體積=1/2長徑×短徑×短徑。

1.2.2 Met對ALDH+細胞生長及相關基因表達的抑制作用

1.2.2.1 ALDH+細胞生長抑制實驗 收集對數生長期的MKN45親本細胞進行計數，以1×106個細胞接種于培養(yǎng)皿，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮細胞。將加入終濃度分別為1、5mmol/L Met的細胞組作為1mmol/L Met組、5mmol/L Met組，以不加藥物的細胞為對照組(命名為MKN45細胞組)，各組處理48h后，流式細胞儀檢測ALDH+細胞比例。

1.2.2.2 RT-PCR檢測干性相關基因Oct4、Sox2和AKT的表達 采用Trizol法提取1.2.2.1所述對照組和實驗組細胞總RNA，取1μg RNA反轉錄為cDNA，以cDNA產物為模板，分別加入Oct4、Sox2、AKT上下游引物，以GAPDH作為內部參照。Oct4上游引物：5'-AGCGAACCAGTATCGAGAAC-3'，下游引物：5'-TTACAGAACCACACTCGGAC-3'；Sox2上游引物：5'-ACACCAATCCCATCCACACT-3'，下游引物：5'-GCAAACTTCCTGCAAAGCTC-3'；AKT上游引物：5'-TCTATGGCGCTGAGATTGTG-3'，下游引物：5'-CTTAATGTGCCCGTCCTTGT-3'；GAPDH上游引物：5'-CCGTCTAGAAAAACCTGCC-5'，下游引物：5'-GCCAAATTCGTTGTCATACC-5'。反應體系含上下游引物各0.4μl，模板cDNA 1μl，ROX對照染料0.4μl，SYBR Premix ExTaq10μl，DEPC水7.8μl，共20μl。95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，40個循環(huán)。利用StepOne軟件進行數據分析，每個標本重復3次，取平均值為Ct值。

1.3 統計學處理 采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以±s表示，計數資料以百分率表示。兩組計量資料滿足正態(tài)、方差齊性的基礎上，采用t進行比較，多組間比較采用方差分析；計數資料的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ALDH+CSC的鑒定和驗證

2.1.1 自我更新能力 如圖1所示，培養(yǎng)分選后的ALDH+和ALDH–細胞均持續(xù)生長，3d后ALDH+組細胞生長速度快于ALDH–組細胞(P＜0.05)。

2.1.2 ALDH+細胞的分化能力 由圖2可見，MKN45親本細胞及其分選出的ALDH+和ALDH–細胞培養(yǎng)1周后，ALDH+的表達率分別為33.8%、37.7%和7.3%。

圖1 ALDH+細胞及ALDH–細胞的生長曲線Fig. 1 Survival curves of ALDH+ and ALDH– cells

圖2 MKN45親本細胞及ALDH+、ALDH–細胞培養(yǎng)1周后ALDH+細胞的比例Fig. 2 Proportion of ALDH+ cell in MKN45 cells, ALDH+ cells and ALDH– cells 7 days after cultivation in vitro

2.1.3 ALDH+細胞的致瘤能力 由圖3可見，ALDH+細胞接種小鼠在第10天出現瘤體，至實驗結束致瘤率為66.7%；ALDH–細胞接種小鼠在第12天出現瘤體，至實驗結束時致瘤率為50%(圖3)。ALDH+細胞接種小鼠的腫瘤體積39.8±33.9mm3，與ALDH–細胞組細胞(12.5±18.5m3)相比差異有統計學意義(P＜0.05)。

圖3 實驗結束時ALDH+細胞組、ALDH–細胞組移植瘤瘤體比較Fig. 3 The size of transplanted tumors in ALDH+ cell group and ALDH– cell group at the end of the experiment

2.2 Met對ALDH+細胞生長的抑制作用 由圖4可見，流式細胞儀檢測MKN45細胞組、1mmol/L Met組、5mmol/L Met組中ALDH+細胞比例分別為29.9%、17.0%、8.7%。重復試驗12次檢測后，MKN45細胞組、1mmol/L Met組、5mmol/L Met組ALDH+細胞比例分別為36.5%±5.4%、15.6%±1.9%和7.6±1.6%，三組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

2.3 Met對Oct4、Sox2和AKT基因表達的影響

2.3.1 Met對干性相關基因Oct4、Sox2 mRNA表達的影響 RT-PCR結果顯示，Oct4 mRNA在1mmol/L Met組表達高于MKN45細胞組，5mmol/L Met組表達低于MKN45細胞組，差異有統計學意義(P＜0.05)。與MKN45細胞組相比，Sox2 mRNA在兩個Met處理組表達均下降，且隨Met濃度升高下降更為明顯，差異有統計學意義(P＜0.05，圖5A、B)。

2.3.2 Met對AKT mRNA表達的影響 由圖5C可見，與MKN45細胞組相比，AKT mRNA在兩個Met處理組中均表達下降，且隨Met濃度升高下降更為明顯，差異有統計學意義(P＜0.05)。

圖4 三組ALDH+細胞比例比較Fig. 4 The proportion of ALDH+ cells in the 3 groups of cells

圖5 三組Oct4、Sox2和AKT mRNA的表達Fig. 5 Expressions of Oct4, Sox2 and AKT mRNA in the 3 groups of cells

3 討 論

CSC的分選鑒定是CSC研究中的關鍵問題。CSC的鑒定一般基于特殊標志物，如膜蛋白或細胞酶[12]、側群細胞(SP細胞)[13]或CD133[14]等具有干細胞特性的分子標志物。ALDH是存在于細胞內的一種依賴NADP的氧化酶，在干細胞的自我保護、分化與增殖方面具有重要作用，是正常干細胞與CSC的主要標志物[15]。在實體瘤中，ALDH可作為CSC的標志物[16]。

本研究對ALDH的生物學特性進行分析顯示，ALDH+細胞的生長速度快于ALDH–細胞，ALDH+和ALDH–細胞培養(yǎng)1周后，ALDH+細胞中分化出ALDH–細胞，分裂后的細胞中ALDH+表達比例接近MKN45親本細胞，該結果說明ALDH+細胞可誘導分化出ALDH–細胞。而ALDH–細胞在培養(yǎng)后也出現了小部分的ALDH+細胞，這是由于具有完整細胞膜的細胞才含有ALDH反應產物，所以ALDEFLUOR?干細胞鑒定試劑不能對死細胞或沒有完整細胞膜的衰老細胞進行鑒定。因此考慮是由于細胞的不均一性、培養(yǎng)條件的不均一性或處于不同細胞周期等因素導致ALDH–細胞培養(yǎng)后中有ALDH+細胞的出現。

致瘤實驗是驗證CSC的金標準[17]。本研究裸鼠成瘤實驗顯示，ALDH+細胞致瘤率高、出瘤早、瘤體大、生長速度快。以上結果從自我更新能力、分化能力和致瘤能力方面證實了胃癌ALDH+細胞具有CSC特性，表明ALDH+細胞可作為靶細胞用于胃癌的治療研究。

有報道證實，在乳腺癌、胰腺癌和惡性膠質瘤中Met可抑制其CSC的生長[18-19]，且Met可抑制卵巢癌CSC-ALDH+細胞的生長和增殖[20]。本實驗研究了Met對ALDH+胃癌CSC的影響，結果顯示，與對照組相比，不同濃度Met均可降低胃癌細胞MKN45中ALDH+細胞的比例，且隨著二甲雙胍濃度的升高，ALDH+細胞的比例明顯下降，表明Met對CSC具有抑制作用。

本實驗還進一步探索了Met對干性相關基因Oct4和Sox2表達的影響。RT-PCR結果顯示，不同濃度的Met作用后，胃癌細胞系中Oct4和Sox2表達量均有變化。Oct4基因在1mmol/L Met作用后出現輕度上調，5mmol/L Met作用后表達明顯下降。Sox2基因在1mmol/L、5mmol/L Met作用后均表現為下調，且隨二甲雙胍濃度升高表達量逐漸下降。Oct4和Sox2基因表達量下降與干細胞量下降有關，此結果與Met抑制ALDH+細胞生長相一致。AKT是PI3K/AKT信號通路相關基因，PI3K/AKT信號通路與細胞的增殖、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生相關[21-22]，AKT過表達與腫瘤組織耐受化療有關[23]。有報道指出，Met可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制ALDH+胰腺癌CSC[24]。本實驗結果顯示，Met作用后AKT基因表達量下降。由于前期實驗已證實Met可抑制ALDH+細胞的增殖，且ALDH+細胞具有干細胞特性，因此推測Met也是通過抑制AKT基因的表達，從而降低ALDH+胃癌干細胞的耐藥性，使ALDH+細胞的增殖受到抑制，進而發(fā)揮抑制胃癌干細胞的作用。當然，該推測還有待進一步研究證實。

綜上所述，Met可抑制胃癌細胞系中ALDH+細胞生長，即可抑制胃癌CSC的生長，其作用機制推測與Met抑制PI3K/AKT信號通路有關。同時Met也可為臨床治療胃癌提供選擇參考。

[1]Lu YJ, Liu SC, Hu YT,et al. Effect of TGF-β1on epithelial mesenchymal transformation and invasion of choriocarcinoma cells[J]. Med J Chin PLA, 2016, 41(2): 114-118. [魯艷杰, 劉紹晨, 胡亞濤, 等. TGF-β1對人絨毛膜癌細胞上皮間質轉化及其遷移能力的促進作用研究[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2016,41(2): 114-118.]

[2]Wang T, Shigdar S, Gantier MP,et al. Cancer stem cell targeted therapy: progress amid controversies[J]. Oncotarget, 2015,6(42): 44191-44206.

[3]Ciurea ME, Georgescu AM, Purcaru SO,et al. Cancer stem cells:biological functions and therapeutically targeting[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(5): 8169-8185.

[4]Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell[J]. Nat Med, 1997, 3(7):730-737.

[5]Meng XP, Wang YP, Zhou YN,et al. Research progress of gastric cancer stem cells[J]. Chin J Gastroenterol Hepatol, 2015,24(10): 1166-1170. [孟雪萍, 王玉平, 郭慶紅, 等. 胃癌干細胞研究進展[J]. 胃腸病學和肝病學雜志, 2015, 24(10): 1166-1170.]

[6]Jiao YY, Zhang JJ, Li WY,et al. Progress research on role of ALDH1 in occurrence and development of cervical cancer[J]. J Jilin Univ (Med Ed), 2017, 43(1): 196-199. [焦園園, 張金金,李萬穎, 等. 乙醛脫氫酶1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中作用的研究進展[J]. 吉林大學學報(醫(yī)學版), 2017, 43(1): 196-199.]

[7]Clark DW, Palle K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets[J]. Ann Transl Med, 2016,4(24): 518.

[8]Del Barco S, Vazquez-Martin A, Cufí S,et al. Metformin: Multifaceted protection against cancer[J]. Oncotarget, 2011, 2(12):896-917.

[9]Wu SW, Zhang ZS, Liu Q,et al. Effect of metformin combined with chemotherapeutic agents on gastric cancer cell line AGS[J].J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2017, 52(1): 37-41. [吳詩文, 張自森, 劉謙, 等. 二甲雙胍聯合化療藥物對人胃癌AGS細胞的作用[J]. 鄭州大學學報(醫(yī)學版), 2017, 52(1): 37-41.]

[10]Wang LY, Zhang BB, He DY,et al. Influence of metformin and paclitaxel in proliferation and apoptosis of ovarian cancer SKOV3 cellsin vitro[J]. J Jilin Univ (Med Ed), 2017, 43(2):255-259. [王立巖, 張貝貝, 赫東蕓, 等. 二甲雙胍和紫杉醇對卵巢癌SKOV3細胞體外增殖和凋亡的影響[J]. 吉林大學學報(醫(yī)學版), 2017, 43(2): 255-259.]

[11]Moreb JS, Ucar D, Han S,et al. The enzymatic activity of human aldehyde dehydrogenases 1A2 and 2(ALDH1A2 and ALDH2) is detected by Aldefluor, inhibited by diethylaminobenzaldehyde and has significant effects on cell proliferation and drug resistance[J]. Chem Biol Interact, 2012, 195(1): 52-60.

[12]Wieczorek K, Niewiarowska J. Cancer stem cells[J]. Postepy Hig Med Dosw (Online), 2012, 66: 629-636.

[13]Zhang HH, Cai AZ, Wei XM,et al. Characterization of cancer stem-like cells in the side population cells of human gastric cancer cell line MKN-45[J]. J Zhejiang Univ Sci B, 2013, 14(3):216-223.

[14]Ren F, Sheng WQ, Du X. CD133: A cancer stem cells marker,is used in colorectal cancers[J]. World J Gastroenterol, 2013,19(17): 2603-2611.

[15]Sládek NE. Human aldehyde dehydrogenases: Potential pathological, pharmacological, and toxicological impact[J]. J Biochem Mol Toxicol, 2003, 17(1): 7-23.

[16]Croker AK, Goodale D, Chu J,et al. High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability[J]. J Cell Mol Med, 2009, 13(8B): 2236-2252.

[17]Boman BM, Wicha MS. Cancer stem cells: a step toward the cure[J]. J Clin Oncol, 2008, 26(17): 2795–2799.

[18]Gou S, Cui P, Li X,et al. Low concentrations of metformin selectively inhibit CD133+cell proliferation in pancreatic cancer and have anticancer[J]. PLoS One, 2013, 8(5): e63969.

[19]Würth R, Pattarozzi A, Gatti M,et al. Metformin selectively affects human glioblastoma tumor-initiating cell viability: A role for metformin-induced inhibition of Akt[J]. Cell Cycle, 2013,12(1): 145-156.

[20]Shank JJ, Yang K, Ghannam J,et al. Metformin targets ovarian cancer stem cellsin vitroandin vivo[J]. Gynecol Oncol, 2012,127(2): 390-397.

[21]Altomare DA, Testa JR. Perturbations of the AKT signaling pathway in human cancer[J]. Oncogene, 2005, 24(50): 7455.

[22]Martini M, De Santis MC, Braccini L,et al. PI3K/AKT signaling pathway and cancer: an updated review[J]. Ann Med, 2014,46(6): 372-383.

[23]Kim D, Dan HC, Park S,et al. AKT/PKB signaling mechanisms in cancer and chemoresistance[J]. Front Biosci, 2005, 10(14):975.

[24]Zhang YN, Ma W, Fan QX,et al. Effects of metformin on ALDH expression in pancreatic cancer and pancreatic cancer stem cells[J]. Cancer Res Prev Treat, 2017, 44(3): 177-183. [張亞娜,馬望, 王峰, 等. Met對胰腺癌和胰腺癌干細胞中ALDH表達的作用[J]. 腫瘤防治研究, 2017, 44(3): 177-183.]