閻 淑， 張 泓

（上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040）

特異性過敏是兒科常見的變態(tài)反應(yīng)性疾病，可嚴(yán)重影響患兒的生活和學(xué)習(xí)質(zhì)量，其重要特征是特異性IgE增加及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[1]。炎癥部位嗜酸性粒細(xì)胞增多與嗜酸性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附密切相關(guān)。細(xì)胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）是一種重要的黏附分子，其受體為淋巴細(xì)胞功能抗原（lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1）。當(dāng)ICAM-1與LFA-1結(jié)合后可使白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間形成牢固結(jié)合，從而趨化白細(xì)胞到炎癥局部。在特異性過敏性炎癥中， ICAM-1可趨化嗜酸性粒細(xì)胞到炎癥部位[2]。此外，有研究還表明，在炎癥性疾病中，白細(xì)胞介素17（interleukin 17，IL-17）可誘導(dǎo)ICAM-1的表達(dá)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞趨化到炎癥部位從而加重炎癥[3]。

發(fā)育內(nèi)皮基因1（developmental endothelial locus-1，Del-1）是組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的糖蛋白，由Edil3基因編碼。Del-1是一種功能強(qiáng)大的內(nèi)源性免疫負(fù)調(diào)控因子，可與LFA-1結(jié)合抑制ICAM-1介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞黏附。最近有研究報(bào)道，Del-1參與了IL-17的炎癥調(diào)控，表現(xiàn)為正常牙周組織中Del-1拮抗IL-17的產(chǎn)生及抑制炎癥反應(yīng)[4]。但在特異性過敏中，Del-1對(duì)ICAM-1介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附的作用尚不清楚。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在特異性過敏中，當(dāng)嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白（eosinophil cationic protein，ECP）表達(dá)上升時(shí)，Del-1表達(dá)下降，提示在特異性過敏中Del-1可能與嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)[5]。為此，本研究擬通過分析Del-1對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞上趨化因子ICAM-1表達(dá)的影響，探討Del-1在特異性過敏中發(fā)揮作用的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院2015年11月—2016年4月特異性過敏患兒35例，其中男16例、女19例，年齡6～10歲，所有患兒血清中特異性IgE（包括吸入性過敏原和食物性過敏原）等級(jí)≥4級(jí)。這些患兒無除過敏以外的急、慢性疾病， 2周內(nèi)無激素使用史。

1.2 方法

1.2.1 磁珠分選（magnetic-activated cell sorting，MACS） 采集患兒室溫（20～25 ℃）肝素抗凝靜脈血10 mL，立即采用嗜酸性粒細(xì)胞分選試劑盒（德國美天旎公司）分選嗜酸性粒細(xì)胞。步驟為：將10 mL血清用1×磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）按1∶1稀釋，沿管壁緩慢疊加于20 mL淋巴細(xì)胞分離液（天津美德太平洋公司）液面上，20 ℃ 600×g離心30 min，保留最下面紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層，用50 mL 1×紅細(xì)胞裂解液懸浮細(xì)胞，常溫孵育10 min，20 ℃以300×g離心8 min，用冰緩沖液（pH值 7.2，1×PBS， 0.5 %牛血清白蛋白，2 mmol/L 乙二胺四乙酸）洗2次，得到富含嗜酸性粒細(xì)胞的粒細(xì)胞群，調(diào)細(xì)胞濃度至1×107/mL。以300×g離心10 min，棄上清，每1×107個(gè)細(xì)胞加入緩沖液40 μL，生物素標(biāo)記的復(fù)合抗體（CD2、CD14、CD16、CD19、CD56、CD123 和 CD235a）10 μL， 充分混勻后4 ～ 8 ℃孵育10 min；每1×107個(gè)細(xì)胞再分別加入緩沖液30 μL、包被于磁珠表面的第二抗體（抗生物素抗體）20 μL，充分混勻后4～8 ℃孵育15 min；加入2 mL緩沖液，以300×g離心10 min，棄上清，加入緩沖液500 μL重懸細(xì)胞；以3 mL緩沖液沖洗MS分選柱，使細(xì)胞懸液通過MS分選柱，收集從MS分選柱中流出的細(xì)胞，即為純化的嗜酸性粒細(xì)胞（陰性分選）；將MS分選柱撤離磁場(chǎng)后以緩沖液沖洗，流出的細(xì)胞懸液即為除嗜酸性粒細(xì)胞以外的粒細(xì)胞（非嗜酸性粒細(xì)胞）。嗜酸性粒細(xì)胞純度用FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）分析鑒定。用臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞，細(xì)胞存活率達(dá)到99%以上。

1.2.2 Del-1處理及細(xì)胞培養(yǎng) 將上述方法中得到的細(xì)胞懸液調(diào)到1×106/mL，加1 mL完全細(xì)胞培養(yǎng)液（RPMI1640加 10% 胎牛血清）至24孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，加入終濃度為5 μg/mL可溶性Del-1抗體（美國R&D Systems公司） 、10 μg/mL抗Del-1（美國R&D Systems公司）或5 ng/mL IL-17蛋白（美國R&D Systems公司）處理。對(duì)照組用PBS處理。在CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reation，PCR）檢測(cè)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 培養(yǎng)后細(xì)胞總RNA的提取方法參照RNAiso Plus試劑盒（大連寶生物公司）說明書進(jìn)行。抽提出的總RNA，采用ABI 7500 system通過一步法逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）及ICAM-1。GAPDH引物序列上游為5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3'，下游為5'-GAAATCCCATCACCATCTTC-3'；ICAM-1引物序列上游為5'- AGGGTAAGGTTCTTGCCCAC-3'，下游為5'- TGATGGGCAGTCAACAGCTA-3'。逆轉(zhuǎn)錄PCR的結(jié)果用2-ΔΔCT方法處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。檢測(cè)結(jié)果以x ±s表示，2個(gè)樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，2個(gè)以上樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Del-1處理后嗜酸性粒細(xì)胞上ICAM-1 mRNA的表達(dá)

為研究Del-1對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞上ICAM-1表達(dá)的影響，用可溶性Del-1處理嗜酸性粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Del-1處理組ICAM-1 mRNA表達(dá)水平（-13.03±2.14）低于對(duì)照組（1.41±0.99），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Del-1處理后嗜酸性粒細(xì)胞上ICAM-1 mRNA的表達(dá)

2.2 抗Del-1抗體處理后嗜酸性粒細(xì)胞上ICAM-1 mRNA的表達(dá)

為進(jìn)一步驗(yàn)證Del-1對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞上ICAM-1表達(dá)的影響，用抗Del-1抗體處理嗜酸性粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抗Del-1抗體處理組ICAM-1 mRNA表達(dá)水平（20.05±4.50）高于對(duì)照組（1.41±0.99），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 抗Del-1抗體處理后嗜酸性粒細(xì)胞上ICAM-1 mRNA的表達(dá)

2.3 Del-1對(duì)IL-17處理后嗜酸性粒細(xì)胞上ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響

為研究IL-17在Del-1抑制嗜酸性粒細(xì)胞中的作用，用可溶性Del-1和/或IL-17處理嗜酸性粒細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-17處理組ICAM-1 mRNA表達(dá)水平（6.51±0.82）高于對(duì)照組（0.94±0.52）（P＜0.05）；Del-1與IL-17共同處理組ICAM-1 mRNA表達(dá)水平（2.48±0.07）低于單獨(dú)IL-17處理組（6.51±0.82）（P＜0.05）。見圖3。

圖3 Del-1對(duì)IL-17處理后嗜酸性粒細(xì)胞上ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響

2.4 Del-1或抗Del-1處理后非嗜酸性粒細(xì)胞上ICAM-1 mRNA的表達(dá)情況

為研究Del-1對(duì)非嗜酸性粒細(xì)胞上ICAM-1表達(dá)的影響，用可溶性Del-1處理非嗜酸性粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Del-1處理組ICAM-1 mRNA表達(dá)水平（-1.27±0.66）與對(duì)照組（-0.09±0.61）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；抗Del-1抗體處理組ICAM-1 mRNA表達(dá)水平（1.67±0.15）與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 Del-1或抗Del-1處理后非嗜酸性粒細(xì)胞上ICAM-1 mRNA的表達(dá)

3 討論

特異性過敏是一類由特異性IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性炎癥性疾病。以嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主，有多種炎性細(xì)胞參與?；罨氖人嵝粤＜?xì)胞可以通過釋放ECP、嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶等細(xì)胞毒性蛋白導(dǎo)致組織直接損傷，其中ECP是嗜酸性粒細(xì)胞活化的主要標(biāo)志物，也是反映過敏性炎癥的重要指標(biāo)之一[6]。我們前期的研究結(jié)果也顯示，在特異性過敏中ECP表達(dá)顯著上升[5]。Del-1是組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的糖蛋白。Del-1的重要生物學(xué)作用是負(fù)向調(diào)控免疫系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，維持組織局部免疫平衡[7]。在ECP明顯升高的特異性過敏中，Del-1的表達(dá)明顯下降[5]，提示Del-1參與了特異性過敏的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)，但具體機(jī)制尚不明確。有研究顯示，在特異性過敏中，嗜酸性粒細(xì)胞穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞聚集于組織局部與過敏性炎癥過程密切相關(guān)，而嗜酸性粒細(xì)胞表面表達(dá)的黏附分子與其聚集密切相關(guān)[8]。ICAM-1是這些黏附分子中重要的一種。為此，本研究從特異性過敏患兒外周血中分離出嗜酸性粒細(xì)胞，用可溶性Del-1處理后檢測(cè)了ICAM-1 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Del-1可以抑制嗜酸性粒細(xì)胞上ICAM-1 mRNA的表達(dá)。提示Del-1可能通過抑制嗜酸性粒細(xì)胞上ICAM-1的表達(dá)抑制嗜酸性粒細(xì)胞趨化到炎癥局部，從而負(fù)向調(diào)節(jié)特異性過敏性炎癥。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Del-1對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞上ICAM-1表達(dá)的影響，本研究用Del-1的中和抗體處理分離出的嗜酸性粒細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗Del-1抗體處理后，嗜酸性粒細(xì)胞上ICAM-1 mRNA的表達(dá)明顯上升，提示Del-1可能通過調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞上ICAM-1的表達(dá)來調(diào)節(jié)特異性過敏中嗜酸性粒細(xì)胞的趨化功能，從而參與特異性過敏炎癥。

特異性過敏主要是由Th1/Th2 細(xì)胞失衡引起。但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥細(xì)胞 Th17也參與其病變的發(fā)生，IL-17 是由 Th17 分泌的炎癥介質(zhì)[9]。在特異性過敏患者的肺泡灌洗液、肺組織、痰液以及外周血標(biāo)本中IL-17表達(dá)明顯升高[10]。我們前期的研究結(jié)果顯示，在特異性過敏患兒肺泡灌洗液中，IL-17表達(dá)明顯升高[5]。升高的IL-17誘導(dǎo)了趨化因子及Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，使嗜酸性粒細(xì)胞在炎癥局部聚集。為此，本研究用IL-17處理外周血分離出的嗜酸性粒細(xì)胞，結(jié)果顯示IL-17可以上調(diào)ICAM-1 mRNA的表達(dá)，這可能是IL-17誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的機(jī)制之一。有研究表明，Del-1參與了IL-17炎癥調(diào)控，表現(xiàn)為正常牙周組織中，Del-1拮抗IL-17的產(chǎn)生及抑制炎癥反應(yīng)[3]。在特異性過敏中，Del-1與IL-17呈直線負(fù)相關(guān)[5]，提示Del-1可能通過影響IL-17的產(chǎn)生和作用影響兒童特異性過敏性疾病的發(fā)生和發(fā)展。為此，本研究在IL-17處理嗜酸性粒細(xì)胞的同時(shí)加入Del-1，分析Del-1對(duì)于IL-17上調(diào)嗜酸性粒細(xì)胞上ICAM-1表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，Del-1可以下調(diào)IL-17誘導(dǎo)的ICAM-1 mRNA表達(dá)，這說明在IL-17表達(dá)升高的特異性過敏性炎癥中，Del-1可以抑制嗜酸性粒細(xì)胞黏附分子表達(dá)，從而抑制特異性過敏中嗜酸性粒細(xì)胞的聚集。

為進(jìn)一步研究Del-1對(duì)過敏性哮喘中粒細(xì)胞趨化作用的影響，本研究用Del-1處理分離嗜酸性粒細(xì)胞后的其他粒細(xì)胞（非嗜酸性粒細(xì)胞）。結(jié)果顯示，不管是用Del-1處理還是用抗Del-1抗體處理，非嗜酸性粒細(xì)胞上ICAM-1 mRNA的表達(dá)都無明顯差異，這可能是由于本研究應(yīng)用特異性過敏患兒標(biāo)本，其非嗜酸性粒細(xì)胞上的ICAM-1表達(dá)本身就低，在炎癥局部聚集并不明顯之故。提示在特異性過敏中Del-1主要作用于嗜酸性粒細(xì)胞表面的ICAM-1，抑制特異性過敏炎癥局部嗜酸性粒細(xì)胞的聚集，從而減輕過敏反應(yīng)。

綜上所述，在特異性過敏中，Del-1可抑制嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)ICAM-1，并且拮抗IL-17誘導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)升高，但對(duì)非嗜酸性粒細(xì)胞的ICAM-1表達(dá)影響不明顯。提示在特異性過敏中，Del-1可能通過調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)ICAM-1，影響特異性過敏性炎癥的發(fā)生和發(fā)展。Del-1可作為兒童特異性過敏安全治療方案的新靶點(diǎn)。

[1]蔡德豐， 陸元善， 袁艷， 等. 兒童急、慢性蕁麻疹I(lǐng)gE及嗜酸性粒細(xì)胞檢測(cè)分析[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2014，29（11）： 1120-1123.

[2]GATAULT S， DELBEKE M， DRISS V， et al.IL-18 is involved in eosinophil-mediated tumoricidal activity against a colon carcinoma cell line by upregulating LFA-1 and ICAM-1[J]. J Immunol，2015， 195 （5）： 2483-2492.

[3]YANG X， YANG J， ZOU H. Baicalin inhibits IL-17-mediated joint inflammation in murine adjuvantinduced arthritis[J]. Clin Dev Immunol， 2013，2013： 268065.

[4]ESKAN M A， JOTWANI R， ABE T， et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss[J]. Nat Immunol，2012， 13（5）： 465-473.

[5]閻淑， 陳黎， 張泓. Del-1在兒童特異性過敏性疾病支氣管肺泡灌洗液中的表達(dá)及其與IL-17的相關(guān)性[J]. 現(xiàn)代免疫學(xué)， 2013， 33（5）： 403-406.

[6]WANG X， ZHANG N， BO M， et al. Diversity of THcytokine profiles in patients with chronic rhinosinusitis： a multicenter study in Europe，Asia， and Oceania[J]. J Allergy Clin Immunol，2016， 138（5）： 1344-1353.

[7]QIN X， LIU J Y， ABDELSAYED R， et al. The status of glucocorticoid-induced leucine zipper protein in the salivary glands in Sj?gren's syndrome： predictive and prognostic potentials[J]. EPMA J， 2016， 7： 3.

[8]JIAO D， WONG C K， QIU H N， et al. NOD2 and TLR2 ligands trigger the activation of basophils and eosinophils by interacting with dermal fibroblasts in atopic dermatitis-like skin inflammation[J]. Cell Mol Immunol， 2016， 13（4）： 535-550.

[9]GAVINO A C， NAHMOD K， BHARADWAJ U，et al. STAT3 inhibition prevents lung inflammation，remodeling， and accumulation of Th2 and Th17 cells in a murine asthma model[J]. Allergy， 2016， 71（12）： 1684-1692.

[10]王娟. Th17細(xì)胞與過敏性疾病[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011， 26（8）： 567-571.