石漢振， 陳 西， 曾冬玉

（1.廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510120；2.中山大學(xué)北校區(qū)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，廣東 廣州 510120；3.越秀區(qū)登峰社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，廣東 廣州 510120）

男性精液質(zhì)量是男性生育能力評(píng)價(jià)、優(yōu)生優(yōu)育的重要指標(biāo)。目前，我國男性精液質(zhì)量水平尚缺乏客觀的、大范圍的調(diào)查。國內(nèi)外關(guān)于使用不同檢測系統(tǒng)或不同檢測方法進(jìn)行精液參考區(qū)間調(diào)查的相關(guān)研究亦較少。黃春妍等[1]的研究結(jié)果顯示，1985—1995年間國內(nèi)男性精液質(zhì)量未見明顯變化，而1995—2008年14年間精子密度和精子總數(shù)明顯降低，可能與我國進(jìn)入重化工時(shí)代引起環(huán)境污染有關(guān)。近30年來，多數(shù)研究認(rèn)為生育期男性精液質(zhì)量逐漸下降，但由于多數(shù)文獻(xiàn)不是大樣本隨機(jī)對(duì)照分析，因此該定論尚缺乏說服力[2]，也有少數(shù)研究認(rèn)為精液質(zhì)量下降證據(jù)尚不充分[3]。精液質(zhì)量研究數(shù)據(jù)最早可追溯到1970年，已發(fā)表的大部分研究是回顧性的，對(duì)混雜因素和偏移難以控制，這可能是結(jié)果不一致的原因[4]。

2010年出版的《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5版）[5]［以下簡稱世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）手冊(cè)］中修訂的精子活力分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)、精子形態(tài)學(xué)的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)和較低的正常參考值（4%）逐漸被國內(nèi)多數(shù)男科實(shí)驗(yàn)室采用[6]。但WHO手冊(cè)對(duì)精液常規(guī)參考區(qū)間的設(shè)定中并沒有涉及來自占世界人口1/5的中國人群的任何臨床數(shù)據(jù)和資料[7]。因此，盡管WHO手冊(cè)非常重要，但能否適用于中國人群仍需評(píng)估[8]。為此，本研究按不同地域人群及檢測系統(tǒng)建立精液常規(guī)分析主要指標(biāo)（精子濃度、精子活動(dòng)力）的參考區(qū)間，并驗(yàn)證其是否適用于廣州地區(qū)的人群，以期為輔助生殖技術(shù)實(shí)施提供更準(zhǔn)確、可靠的精液質(zhì)量數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2015年10月—2016年2月廣東省中醫(yī)院145名體檢健康男性的精液標(biāo)本。

1.2 入選及排除標(biāo)準(zhǔn)

145份標(biāo)本均來自2年內(nèi)已生育過健康孩子的男性，排除生殖道或泌尿道慢性炎癥、遺傳性疾病、生殖道器質(zhì)性疾病和有嚴(yán)重生活不良習(xí)慣者。由于精子質(zhì)量存在地域性和種族間差異，環(huán)境因素如有毒物質(zhì)、殺蟲劑、油漆等化學(xué)物質(zhì)暴露可影響精液質(zhì)量，體質(zhì)指數(shù)和營養(yǎng)狀況對(duì)精液質(zhì)量的影響也是不可忽視的，另外吸煙、飲酒、久坐工作等生活方式也可對(duì)男性生殖健康造成損害。因此，在選取參考個(gè)體時(shí)要考慮排除以上的影響因素。

1.3 儀器與試劑

SCA精子質(zhì)量分析儀（西班牙Microptic公司）、Marker計(jì)數(shù)板、改良牛鮑計(jì)數(shù)板、恒溫水浴箱、光學(xué)顯微鏡、精子固定液、玻璃染缸、玻片、蓋玻片和10 mL塑料試管。

1.4 方法

1.4.1 收集標(biāo)本 要求受試者禁欲2～7 d，取精室手淫取精，收集1次射精的全部精液于清潔、無毒密閉容器內(nèi)，置37 ℃水浴箱中，待液化后進(jìn)行精液分析。

1.4.2 計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（computer assisted sperm analysis，CASA）操作步驟 將1滴已液化的精液均勻涂抹在潔凈玻片上，在顯微鏡低倍鏡下作初步鏡檢。根據(jù)精子濃度估算稀釋倍數(shù)，用生理鹽水將精子濃度調(diào)整到（20～50）×106/mL，用加樣槍吸取10 μL精液加樣到專用計(jì)數(shù)板上；使用SCA精子質(zhì)量分析儀檢測精子濃度、前向精子總數(shù)、總活動(dòng)率、前向活動(dòng)率。

1.4.3 Marker計(jì)數(shù)板操作步驟 將按適當(dāng)比例稀釋后的精液吸取10 μL滴于Marker平盤中心區(qū)域，將蓋子蓋上，于20倍物鏡顯微鏡下找到視野后計(jì)數(shù)10個(gè)方格，計(jì)算精子濃度，并使用計(jì)數(shù)器分類計(jì)算精子活動(dòng)力。

1.4.4 改良牛鮑計(jì)數(shù)板操作步驟 將計(jì)數(shù)板用擦鏡紙擦凈，在中央計(jì)數(shù)室上加蓋專用厚玻片。將稀釋后的精液用吸管吸取1滴置于蓋玻片邊緣，使精液緩緩滲入，室溫放置3 min，待精子全部沉降到計(jì)數(shù)室內(nèi)后計(jì)數(shù)16個(gè)小方格內(nèi)的精子數(shù)量。每份標(biāo)本均計(jì)數(shù)3次，取平均值，按公式計(jì)算精子濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.5.1 建立參考區(qū)間 去除離群值采用Dixon 所提出的1/3規(guī)則。D值指一個(gè)極端觀測值（大的或小的值）和另一個(gè)極端觀測值（第二大或第二小的值）之間的絕對(duì)差值，而R值指所有觀測值全距，即最大極值和最小極值差值。如某個(gè)觀測值D值≥1/3 R值，就應(yīng)剔除該極值。去除離群值后，隨機(jī)抽取不少于120例進(jìn)行分析。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單側(cè)參考區(qū)間取95%可信區(qū)間[10]。

1.5.2 驗(yàn)證參考區(qū)間 從健康體檢人群中另抽取20名健康個(gè)體（2年內(nèi)已生育的男性）進(jìn)行精液常規(guī)分析。如20名健康個(gè)體中只有不超過2名個(gè)體的檢測值超出原始參考區(qū)間（取95%可信區(qū)間），即通過驗(yàn)證［11］。

1.6 質(zhì)量控制

精液檢驗(yàn)質(zhì)量控制環(huán)節(jié)應(yīng)規(guī)范受試者采樣前準(zhǔn)備（包括禁欲時(shí)間）和精液采集方法、及時(shí)送檢、37 ℃溫浴避免精子自身破壞溶解、標(biāo)本收集后及時(shí)處理[12]。分析過程中應(yīng)注意加樣、稀釋的規(guī)范操作，盡量由同一實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行操作，以減少人為誤差，同一標(biāo)本可做2次或多次平行試驗(yàn)，以縮小隨機(jī)誤差。對(duì)使用的設(shè)備、儀器、試劑、加樣槍校準(zhǔn)、質(zhì)控應(yīng)有標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。同一標(biāo)本應(yīng)選取不同視野重復(fù)計(jì)數(shù)，嚴(yán)格遵循WHO手冊(cè)上“對(duì)一定總數(shù)2個(gè)重復(fù)計(jì)數(shù)可接收差異”的要求，控制主觀因素引起的誤差[9]。此外，為保證避免儀器本身帶來的誤差，需依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP15-A2文件對(duì)3種儀器進(jìn)行正確度評(píng)價(jià)。收集5份標(biāo)本（結(jié)果盡量分散于檢測范圍高、中、低點(diǎn)）分別用3種儀器進(jìn)行精子濃度與活動(dòng)力檢測。以牛鮑計(jì)數(shù)板為參考系統(tǒng)，比較Marker計(jì)數(shù)板和CASA的相對(duì)偏移，如果相對(duì)偏移＞15%，需查找原因，對(duì)Marker計(jì)數(shù)板和CASA進(jìn)行校準(zhǔn)。

2 結(jié)果

145名受試者檢測結(jié)果均呈正態(tài)分布，其中有8個(gè)離群值，按照要求予以剔除，剩余137個(gè)結(jié)果用于統(tǒng)計(jì)。

CASA、Marker計(jì)數(shù)板、改良牛鮑計(jì)數(shù)板檢測精子濃度的參考區(qū)間分別為≥27.60×106/mL、≥35.40×106/mL、≥31.00×106/mL。CASA、Marker計(jì)數(shù)板檢測精子總活動(dòng)力的參考區(qū)間分別為≥40.90%、≥49.40%，前向活動(dòng)力的參考區(qū)間分別為≥32.20%、≥35.00%。用于驗(yàn)證的20名健康個(gè)體的精液常規(guī)檢測結(jié)果均在參考區(qū)間內(nèi)。本研究建立的參考區(qū)間見表1。不同檢測系統(tǒng)精液常規(guī)分析單側(cè)生物參考區(qū)間低值及95%可信區(qū)間見表2。

表1 不同檢測系統(tǒng)精液常規(guī)分析結(jié)果

表2 不同檢測系統(tǒng)精液常規(guī)分析參考區(qū)間低值及95%可信區(qū)間

3 討論

參考區(qū)間是目前臨床實(shí)驗(yàn)室最常用的解釋檢驗(yàn)報(bào)告的一個(gè)“決策支持工具”[13]。臨床實(shí)驗(yàn)室的檢測結(jié)果常與參考區(qū)間作比較，以判斷其有無臨床意義。不同地區(qū)健康人群的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果有顯著差異[14]。ICHIHARA等[15]進(jìn)行的一項(xiàng)隨訪研究不僅證實(shí)了文獻(xiàn)[14]的研究結(jié)果，還指出了差異的生物學(xué)基礎(chǔ)。參考區(qū)間建立要注意以下問題：（1）生物屬性帶來參考區(qū)間的差異（主要是年齡、性別、民族、居住地域及妊娠等原因引起的差異）[16]；（2）對(duì)于同一項(xiàng)目的檢測方法可能有多種等[17]。因此，各實(shí)驗(yàn)室有必要建立自己的參考區(qū)間。簡單地引用文獻(xiàn)或直接采用廠商給定的參考區(qū)間是不可取的。目前，建立適合我國人群檢驗(yàn)項(xiàng)目的參考區(qū)間具有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。通過轉(zhuǎn)移驗(yàn)證已建立的參考區(qū)間來確定自己實(shí)驗(yàn)室的參考區(qū)間，可以避免不必要的重復(fù)檢測或臨床干預(yù)，有效提高臨床醫(yī)生評(píng)價(jià)患者精液質(zhì)量及生育能力的診斷準(zhǔn)確性，且同時(shí)為輔助生殖技術(shù)提供更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷。

精子濃度及活動(dòng)力檢測有多種方法，但WHO手冊(cè)中只有手工方法（改良牛鮑計(jì)數(shù)板）的參考區(qū)間。隨著CASA在我國男科實(shí)驗(yàn)室中的廣泛應(yīng)用，使用計(jì)數(shù)池計(jì)數(shù)精子的男科實(shí)驗(yàn)室越來越少。此外，Marker計(jì)數(shù)板也是常規(guī)用于精子濃度計(jì)數(shù)的工具之一[18-19]。因此，迫切需要建立這2種方法的參考區(qū)間。為此，結(jié)合地區(qū)人群差異，本研究建立了廣州地區(qū)3種檢測系統(tǒng)精液常規(guī)分析主要指標(biāo)的參考區(qū)間。

將本研究建立的精液質(zhì)量參考區(qū)間與WHO手冊(cè)比較，其中精子濃度及精子總數(shù)二者差異較大，主要是由本研究納入病例數(shù)不多、方法學(xué)差異、檢測技術(shù)誤差等原因引起。精子活動(dòng)力差異較小，差異可能是由檢測技術(shù)誤差以及CASA將精液中其他雜質(zhì)錯(cuò)誤分類等原因引起。因此，在以后的研究中將通過增大納入病例數(shù)、減少檢測技術(shù)誤差等手段對(duì)精液質(zhì)量參考區(qū)間進(jìn)行修正。按WHO手冊(cè)要求，精液參考區(qū)間納入試驗(yàn)者要求是其配偶在停止使用避孕措施后12個(gè)月內(nèi)懷孕，但招募這類課題參與者困難很大，因此本研究將妊娠期限定為24個(gè)月內(nèi)。此外，由于目前精液檢查儀器或方法缺乏權(quán)威性室間質(zhì)評(píng)結(jié)果及性能評(píng)價(jià)方法，因此均可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)生偏差。

[1]黃春妍，姚陳均，王春，等. 1985～2008年間我國正常男性精液質(zhì)量變化分析[J]. 中華男科學(xué)雜志，2010，16（8）：684-688.

[2]謝偉， 張海英. 中國生育男性精液質(zhì)量現(xiàn)狀和研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述， 2014，20（14）：2562-2564.

[3]修瑞杰， 趙璐， 董艷， 等. 天津市120例有生育力男性精液質(zhì)量分析[J]．國際生殖健康/計(jì)劃生育雜志， 2012，31（2）：105-107．

[4]黃莉萍，李亞斐，熊鴻燕，等. 近25年中國正常男性精液質(zhì)量的變化趨勢(shì)分析[J]. 生殖與避孕，2011，31（2）：122-128.

[5]世界衛(wèi)生組織. 世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)[M]. 5版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：2.

[6]SARABIA L， MUNUCE M J. Updated reference values for sperm counts （WHO 2010）[J]. Rev Med Chil， 2011，139（4）：548-549.

[7]CAO X W， LIN K， LI C Y， et al. A review of WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen（5th edition）[J].Zhonghua Nan Ke Xue， 2011，17（12）： 1059-1063.

[8]陸金春， 黃宇烽， 呂年青.《世界衛(wèi)生組織人類精液分析實(shí)驗(yàn)室技術(shù)手冊(cè)》與我國男科實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)狀[J]. 中華男科學(xué)雜志， 2010，16（10）：867-871.

[9]Clinical and Laboratory Standards Institute.Defining， establishing， and verifying reference intervals in the clinical laboratory [S]. C28-A3，CLSI，2008．

[10]National Committee for Clinical Laboratory Standards.How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory [S]. C28-A2， NCCLS， 2000．

[11]王洪亞， 張捷. 建立檢驗(yàn)項(xiàng)目參考區(qū)間的探討[J].臨床檢驗(yàn)雜志， 2011，29（7）：548-550.

[12]陳振文. 精液分析標(biāo)準(zhǔn)化和精液質(zhì)量評(píng)估[J]. 中國計(jì)劃生育學(xué)雜志，2006，14（10）：634-637.

[13]JONES G， BARKER A. Reference intervals [J]. Clin Biochem Rev， 2008，29（Suppl 1）：S93-S97.

[14]ICHIHARA K， ITOH Y， MIN W K， et al.Diagnostic and epidemiological implications of regional differences in serum concentrations of proteins observed in six Asian cities[J]. Clin Chem Lab Med， 2004，42（7）：800-809.

[15]ICHIHARA K， ITOH Y， LAM C W， et al.Sources of variation of commonly measured serum analytes in 6 Asian cities and consideration of common reference intervals[J]. Clin Chem， 2008，54（2）：356-365.

[16]陳喜軍，陳發(fā)林，王友基. 福建省三級(jí)醫(yī)院臨床檢驗(yàn)互認(rèn)項(xiàng)目參考區(qū)間現(xiàn)況[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2016，31（5）：419-422.

[17]沈雋霏，宋斌斌，潘柏申. 間接法建立生物參考區(qū)間[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2015，30（4）：391-396.

[18]張圣強(qiáng)， 張曼. 計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)在精液質(zhì)量檢測中的應(yīng)用[J]. 中國衛(wèi)生信息管理雜志，2011，8（6）：48-51.

[19]黃宇烽， 陸金春. 精子質(zhì)量參數(shù)分析的標(biāo)準(zhǔn)化與質(zhì)量控制的研究進(jìn)展[J]. 中華男科學(xué)雜志， 2007，13（11）：963-968.