喬寶營(yíng), 孫雷明, 張 柯, 孫文英*, 黃海帆, 劉崇懷

(1. 河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院, 中牟 451450; 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所, 鄭州 450009;3. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所, 鄭州 450002)

葡萄霜霉病由葡萄霜霉病菌引起,遍及世界各葡萄產(chǎn)區(qū),是危害葡萄的重要病害之一。葡萄霜霉病在中國(guó)的各葡萄產(chǎn)區(qū)均有分布,特別是在多雨潮濕地區(qū),發(fā)病更為嚴(yán)重,甚至還會(huì)影響翌年病害的發(fā)生率[1],給葡萄生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前生產(chǎn)上主要通過(guò)使用化學(xué)殺菌劑防治霜霉病[2],這不僅會(huì)因農(nóng)藥殘留而降低果品質(zhì)量,而且還會(huì)污染環(huán)境,給人們的身體健康造成潛在威脅,所以近年來(lái)一些研究者從綠色環(huán)保的角度出發(fā),在篩選抗病品種以及培育抗病新品種方面做了大量工作[3-7]。本文結(jié)合前人對(duì)葡萄抗霜霉病的研究成果主要從植物學(xué)特征、生理生化性狀、與病害遺傳關(guān)系以及有關(guān)抗霜霉病分子研究三方面分別進(jìn)行了分析和探討,希望為葡萄霜霉病抗性的研究與霜霉病防治提供依據(jù)。

1 結(jié)構(gòu)抗性

1.1 葉片氣孔結(jié)構(gòu)與抗病性

王國(guó)英[8]對(duì)抗病性不同的葡萄葉片的氣孔進(jìn)行了電鏡掃描和光學(xué)顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)葉片氣孔的密度和結(jié)構(gòu)與葡萄抗霜霉病存在著一定的關(guān)系,抗病葡萄葉片氣孔小、稀少,氣孔周圍有白色的堆積物,而感病類型的氣孔大、密集;徐紅霞等[9]、喬寶營(yíng)等[10]認(rèn)為葡萄品種感霜霉病程度與葉片氣孔大小和氣孔密度呈正相關(guān),葉片氣孔密而大時(shí)感病,稀而小時(shí)抗病,可以利用葡萄葉表氣孔密度直接作為霜霉病抗病性鑒定指標(biāo)之一;劉天明等[11]則認(rèn)為,葡萄對(duì)霜霉病的抗性與氣孔開張度、氣孔密度無(wú)相關(guān)性。

1.2 葉片表皮結(jié)構(gòu)、葉背茸毛與抗病性的關(guān)系

Boubals[12]認(rèn)為有些葡萄品種葉片的下表皮多毛,有的下表皮有一蠟質(zhì)層,這些結(jié)構(gòu)使葉表面不易濕潤(rùn)而使游動(dòng)孢子不能侵入葉片表皮而發(fā)芽;徐紅霞等[9]認(rèn)為葡萄葉背茸毛極密的品種抗霜霉病,因?yàn)闈饷艿娜酌钃趿瞬≡那秩搿?/p>

2 生理生化抗性

2.1 過(guò)敏性的抗病反應(yīng)

葡萄對(duì)霜霉病的防御反應(yīng),最明顯的是葡萄具有過(guò)敏性壞死反應(yīng)。過(guò)敏性壞死反應(yīng)是指病菌侵染抗病品種后,被侵入的細(xì)胞很快會(huì)失去活力而死亡;而侵染感病品種后,被侵細(xì)胞卻可活很久。有研究表明:過(guò)敏性反應(yīng)的基本特征是細(xì)胞內(nèi)單寧類、酚類化合物和其氧化衍生物的累積,這些物質(zhì)可能在病菌感染前就已經(jīng)積累了足夠的數(shù)量阻止病菌侵入,但是在多數(shù)情況下它們是在感染后被誘導(dǎo)產(chǎn)生而積累起來(lái)的。王國(guó)英[8]的研究表明:瘤枝葡萄中的‘嵐-5株系’、‘河岸葡萄’、‘藍(lán)葡萄’,秋葡萄中的‘江秋-2’、復(fù)葉葡萄的‘留-8’和‘留-9’、華東葡萄的‘白-13-1’、‘白-35-1’、‘白-36-1’株系以及山葡萄都具有過(guò)敏性的抗病反應(yīng)。Diez-navajas等[13]在研究中發(fā)現(xiàn)接種霜霉病病原菌數(shù)小時(shí)后,抗霜霉病葡萄品種在感染的氣孔周圍觀察到過(guò)敏反應(yīng),有時(shí)候會(huì)產(chǎn)生壞死病斑。

2.2 產(chǎn)生毒素的抗病反應(yīng)

植物抗毒素是指在植物受到機(jī)械損傷或各種病原物侵染后,會(huì)產(chǎn)生具有一定量的有毒物質(zhì),當(dāng)其累積到一定濃度時(shí)可以抑制病菌的發(fā)展,植物表現(xiàn)抗性。Abadzhyan[14]用感霜霉病品種與抗病品種做人工接種試驗(yàn),7 d后經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn),抗霜霉病品種產(chǎn)生的植物抗毒素和細(xì)胞間有毒物質(zhì)的毒性比感病品種強(qiáng),這種毒性使霜霉病菌游動(dòng)孢子死亡,抑制其感染蔓延至整個(gè)葉片。

2.3 酶活性與抗病反應(yīng)

酶活性與葡萄抗霜霉病有密切的關(guān)系,現(xiàn)在研究的酶類主要包括過(guò)氧化物酶(POD)[15]、過(guò)氧化氫酶(CAT)、多酚氧化酶 (PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)[16]、幾丁質(zhì)酶(chitinase)[17]、芪合酶(STS)[18]等。Dai等[15]分別觀察接種霜霉病菌的感病、中抗和高抗葡萄品種,發(fā)現(xiàn)中抗品種接種后5 d檢測(cè)到過(guò)氧化物酶的活性。史娟等[19]、房玉林等[20]的研究表明,過(guò)氧化物酶(POD)活性與葡萄對(duì)霜霉菌的抗性密切相關(guān),不同抗病性品種葉片感染霜霉病菌后POD活性在升高的速度和幅度上有顯著的差異,與感病品種‘乍娜’、‘紅地球’相比,抗病品種‘赤霞珠’的POD活性升速快、變化幅度大,而且POD高活性持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)。林玲等[21]對(duì)高抗霜霉菌的毛葡萄野生株系接種霜霉病菌后檢測(cè)其葉片內(nèi)的POD活性,結(jié)果表明POD活性升高幅度明顯高于感病的歐美雜種‘醉人香’和‘H-Norris’。而Abadzhyan[14]則研究認(rèn)為,在受病原菌侵染的局部組織,POD活性升高快,出現(xiàn)壞死斑,感病品種的葉片內(nèi)POD活性高于抗病品種,并且差異達(dá)到極顯著水平。齊慧霞等[22]對(duì)不同抗性的釀酒品種進(jìn)行接種鑒定,認(rèn)為感病品種接種后POD活性呈遞增趨勢(shì),而抗病品種則呈遞減趨勢(shì)。

呂秀蘭等[23]、Perepelitsa等[24]發(fā)現(xiàn),在葡萄未感病時(shí)CAT活性與抗病性之間關(guān)系不密切,但接種發(fā)病后供試葡萄品種CAT活性與霜霉病病情指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān),認(rèn)為CAT的活性可作為葡萄品種對(duì)霜霉病抗性的一種輔助評(píng)價(jià)指標(biāo)。而林玲等[21]認(rèn)為不論抗病還是感病品種,在接種霜霉病菌后葡萄葉片內(nèi)CAT活性均呈下降趨勢(shì)。

葡萄葉片接種霜霉病菌后,抗病品種和感病品種PPO活性有顯著的差異,抗病品種在接種后PPO活性不僅升速快、而且幅度大。感病品種接種后的PPO活性則下降[14, 24]。而呂秀蘭等[23]的研究表明,PPO活性與葡萄霜霉病病情指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)。

齊慧霞等[25]研究認(rèn)為SOD活性在酒葡萄品種間存在著很大的差異,不同品種接種霜霉病菌后的SOD活性均高于接種前,并隨著發(fā)病程度加重,其活性則呈上升趨勢(shì)。但接種霜霉病菌后4～12 d內(nèi),葉片SOD活性有的呈遞減趨勢(shì),也有的呈遞增趨勢(shì)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在葡萄霜霉菌誘導(dǎo)下抗病品種‘SV6059’體內(nèi)SOD酶活性6 d內(nèi)基本恢復(fù)到正常狀態(tài),其自我調(diào)節(jié)恢復(fù)能力顯著大于感病品種 ‘品麗珠’。呂秀蘭等[23]則認(rèn)為,接種前和接種后2 d,供試葡萄品種SOD活性和霜霉病發(fā)病指數(shù)相關(guān)性不顯著。林玲等[21]研究了毛葡萄接種霜霉病菌后SOD活性的變化情況,發(fā)現(xiàn)供試的5個(gè)毛葡萄野生株系、1個(gè)毛葡萄與歐亞種雜交后代、兩個(gè)歐美雜種接種霜霉病菌后SOD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。

近年來(lái),苯丙烷代謝與植物抗病性的關(guān)系,也引起了人們的重視。Perepelitsa等[24]研究認(rèn)為PAL活性與葡萄對(duì)霜霉菌的抗性呈正相關(guān),隨著PAL活性的變化,綠原酸和木質(zhì)素在抗病品種中積累的速度和量大于感病品種,可能由PAL控制的苯丙烷代謝也是葡萄對(duì)霜霉病的抗性機(jī)制之一,PAL活性可作為葡萄品種抗霜霉病的一種輔助評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2.4 氮代謝與抗霜霉病的關(guān)系

氮代謝也是抗霜霉病機(jī)制研究的一個(gè)重要內(nèi)容。寄主受到病原菌侵染后能夠產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白,這種蛋白可能與抗病基因表達(dá)有關(guān)。Margaryan[26]研究發(fā)現(xiàn)所有感病植株的葉片總氮和蛋白質(zhì)含量下降。Antonyan等[27-28]認(rèn)為,對(duì)感病品種,健康葉片內(nèi)天冬氨酸和谷氨酸的含量較高,而被霜霉病菌侵染后這些氨基酸的含量下降,而對(duì)抗病品種,被霜霉病菌侵染后葉片內(nèi)氨基酸的含量反而上升。進(jìn)一步測(cè)定感病和抗病品種的葉片及新梢的蛋白質(zhì)含量,發(fā)現(xiàn)兩種類型的蛋白質(zhì)含量相似。齊慧霞等[25]也認(rèn)為,隨著發(fā)病程度加重,葡萄葉片內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸下降。但也有研究認(rèn)為葡萄感染霜霉病程度與葉內(nèi)游離氨基酸含量無(wú)顯著相關(guān)性[11]。因此,可以推測(cè)抗病品種和感病品種合成蛋白質(zhì)的能力明顯不同,氮代謝呈現(xiàn)出復(fù)雜性變化。

2.5 葉綠素含量與葡萄霜霉病的關(guān)系

葡萄品種葉片內(nèi)葉綠素含量與霜霉病感病程度呈極顯著正相關(guān)。感病品種葉片內(nèi)葉綠素含量比抗病品種高,但在發(fā)生霜霉病后抗病品種能抑制葉綠素含量的下降,使葉綠素含量很快恢復(fù)到正常的狀態(tài),即葉片葉綠素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)降幅與葉片病情指數(shù)呈顯著正相關(guān)[29]。葡萄感霜霉病程度與葉綠素a和葉綠素b的總量有密切關(guān)系,葉綠素總量越大的品種則越抗病,反之則越感病[6]。但也有研究認(rèn)為葉綠素a的含量影響品種抗病程度,且效果明顯,葉綠素b的含量與抗病性關(guān)系不大[30]。

2.6 可溶性糖含量與抗病性的關(guān)系

Margaryan[26]認(rèn)為抗霜霉病葡萄品種葉片中蔗糖含量低,而感病品種葉片中其含量較高;齊慧霞等[22,25]卻認(rèn)為抗病品種葉片內(nèi)可溶性糖含量高于感病品種,在感染霜霉病后,可溶性糖含量呈下降趨勢(shì);但也有研究認(rèn)為,葡萄對(duì)霜霉病的抗性與品種葉內(nèi)的還原糖、淀粉等含量無(wú)顯著相關(guān),而外施高濃度蔗糖能顯著降低霜霉病菌的致病力[11,31]。

2.7 酚類物質(zhì)與抗病性的關(guān)系

植物組織內(nèi)的酚類物質(zhì)為木質(zhì)素的合成提供大量的前體物質(zhì),有利于提高組織的成熟度,增強(qiáng)其抗逆性[32]。Margaryan[26]和Abadzhyan[31]認(rèn)為高抗霜霉病的葡萄品種,其多酚含量也高。有研究使用高濃度鄰苯二酚處理離體葉片,發(fā)現(xiàn)其對(duì)霜霉病菌有明顯的抑制作用,因此認(rèn)為酚類物質(zhì)可能是葡萄抗霜霉菌擴(kuò)展的主要物質(zhì)[11,30]。

2.8 其他礦質(zhì)元素與抗病性的關(guān)系

葡萄葉片中磷鉀養(yǎng)分含量與抗霜霉病也具有一定的相關(guān)性,當(dāng)葉片中磷含量達(dá)0.14%,鉀含量達(dá)2.1%時(shí),葉片發(fā)病率比對(duì)照降低40%左右[33]。鈣鉀比例也會(huì)影響品種的抗性,鉀含量與品種的抗病性呈負(fù)相關(guān),葡萄細(xì)胞液中Ca/K比是決定抗霜霉病的一個(gè)重要因素,Ca/K比隨抗病程度而增加[9]。喬寶營(yíng)等[10]則認(rèn)為葡萄葉片中氮含量、磷含量、鉀含量與霜霉病發(fā)病程度關(guān)系不顯著。

3 與其他葡萄病害的遺傳相關(guān)性

葡萄霜霉病與其他病害也有一定的抗性遺傳關(guān)系,劉會(huì)寧等研究認(rèn)為歐亞種品種感霜霉病和黑痘病之間是負(fù)相關(guān)的關(guān)系,但相關(guān)性不顯著,而歐亞種品種(系)后代對(duì)霜霉病和白粉病的抗病性存在極顯著相關(guān)性[34-36]。另外,胼胝體積累被認(rèn)為是抵抗霜霉病的反應(yīng)物之一,H2O2也是一個(gè)重要的防御信號(hào),Liu等[37]使用3種中國(guó)野生抗病葡萄 (華東葡萄‘Baihe-35-1’, 刺葡萄‘Langao-5’和復(fù)葉葡萄‘Liuba-8’)和歐亞種易感品種(‘Pinot noir’),進(jìn)行了病理學(xué)上的研究,通過(guò)苯胺藍(lán)染色表明3種中國(guó)野生抗病葡萄上有胼胝體積累,‘Baihe-35-1’還具有特殊的熒光光譜,使用3,3-二氨基聯(lián)苯胺進(jìn)行比色,在‘Langao-5’和‘Liuba-8上產(chǎn)生了H2O2,這些特征在易感霜霉病的歐亞種‘Pinot noir’上則不存在。

4 分子抗性

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,葡萄抗霜霉病機(jī)制的研究已經(jīng)深入到分子水平。Kim[38]認(rèn)為葡萄抗霜霉病是由單基因控制,并存在修飾基因;何寧等[39]認(rèn)為山葡萄抗霜霉病是受一對(duì)具有顯隱性關(guān)系基因控制;李華等[40]、賀普超等[41]、宋潤(rùn)剛等[42]則認(rèn)為葡萄抗霜霉病為表現(xiàn)數(shù)量性狀遺傳特征的多基因控制,抗病類型中的品種或品系中存在抗病的微效多基因并表現(xiàn)為累加性效應(yīng);Luo等[43]用BSA、SCAR和RAPD方法研究了葡萄感霜霉病基因的分子標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)RAPD標(biāo)記OPO10-800與葡萄感霜霉病主效基因緊密連鎖,將該DNA片段克隆并測(cè)序,并將OPO10-835RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記SCO10-835;此外,還發(fā)現(xiàn)RAPD標(biāo)記OPO06-1500與葡萄抗霜霉病主效基因RPV1緊密連鎖,并將此RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記SCO06-1500,這兩個(gè)SCAR標(biāo)記均可用于葡萄對(duì)霜霉病的抗病與感病性鑒定。Fischer等[44]和Welter等[45]在18號(hào)連鎖群上定位了一個(gè)抗霜霉病的主效基因,在4號(hào)連鎖群上定位了一個(gè)微效基因;Kortekamp等[46]通過(guò)差異顯示技術(shù)對(duì)抗病的河岸葡萄和感病的歐洲葡萄進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)并分離到一個(gè)定位10號(hào)連鎖群的VRP-1 抗病基因。Marguerit等[47]利用歐洲種‘赤霞珠’與美洲河岸葡萄‘Gloire de Montpellier’的138株雜交個(gè)體在12號(hào)連鎖群定位了2個(gè)新的跟霜霉抗性相關(guān)的位點(diǎn)Rpv5和Rpv6;Moreira等[48]分別利用‘Moscato Bianco’和V.riparia174個(gè)雜交一代,‘VRH3082 1-42’和‘SK77 5/3’94個(gè)雜交后代構(gòu)建了兩張葡萄染色體連鎖圖譜,抗霜霉病的QTLs主要定位在第一張圖譜的7、12連鎖群上和第二張圖譜的7、8、12連鎖群上。

在定位葡萄霜霉病抗性QTLs的同時(shí),研究者們也試圖克隆得到抗霜霉病的相關(guān)基因。Wu[49]等用Solexa測(cè)序的方法得到一些可能與抗霜霉病相關(guān)的基因和通路,從感病樣品中獲得15 249個(gè)基因,對(duì)照中獲得14 549 個(gè)基因,感病樣品與對(duì)照的差異表達(dá)基因富集的通路涉及核糖體代謝、光合作用、氨基酸與糖代謝以及淀粉和蔗糖代謝,Rpv1、NPR1的同源基因和PR蛋白編碼基因與葡萄霜霉病抗病機(jī)制有關(guān)。Polesani等[50]采用cDNA-AFLP技術(shù)分析感病品種‘雷司令’霜霉病感染的葉片,得到804個(gè)轉(zhuǎn)錄本,這為闡明霜霉病侵染過(guò)程的分子機(jī)制及識(shí)別抑制病原菌的相關(guān)基因提供了幫助。王平等[51]獲得10個(gè)與已知抗病基因相似保守結(jié)構(gòu)域的葡萄抗病基因同源片段(RGA),同時(shí)定量PCR分析出RGA1、RGA2、RGA5和RGA23在感染霜霉菌后顯著表達(dá),推測(cè)可能與葡萄抗霜霉病有關(guān),使得克隆出抗霜霉病基因成為可能?？紫榫玫萚52]獲得葡萄霜霉菌候選效應(yīng)子RXLR5信號(hào)肽,推測(cè)可能從葡萄霜霉菌細(xì)胞內(nèi)分泌到胞外的過(guò)程中起重要作用。

不同基因型的葡萄對(duì)霜霉病的抗性也不同,V.vinifera葡萄對(duì)霜霉病敏感,V.rupestris葡萄中抗,V.amurensis葡萄抗霜霉病,圓葉葡萄則對(duì)霜霉病完全免疫[53]。Figueiredo等[54]利用基因芯片技術(shù),在121個(gè)轉(zhuǎn)錄本中,發(fā)現(xiàn)代表感病‘Regent’和抗病的 ‘Trincadera’的29個(gè)差異表達(dá)基因。

5 小結(jié)

霜霉病不僅嚴(yán)重影響了葡萄的生長(zhǎng)還影響了產(chǎn)量和品質(zhì)?，F(xiàn)今關(guān)于葡萄霜霉病抗性的研究雖然取得了一定的進(jìn)展,但是由于不同葡萄品種(類型)對(duì)霜霉病的抗性強(qiáng)弱與其自身的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化特性有著緊密的聯(lián)系,所以研究者往往在對(duì)葡萄霜霉病抗性的研究方面存在不同的見解。葡萄對(duì)霜霉病的抗病性涉及諸多因素,各因素間關(guān)系復(fù)雜,雖然至今未能確定出葡萄抗霜霉病的決定性因子,但是通過(guò)對(duì)抗性品種的抗病機(jī)制、遺傳進(jìn)程或抗病基因的研究,結(jié)合長(zhǎng)期雜交育種或轉(zhuǎn)基因的方式,將抗霜霉病性狀與葡萄優(yōu)良性狀相結(jié)合,培育抗病品種是解決霜霉病的最安全有效、最有前景的方法。