鄭彥文　蔡靖　仲兆民

【摘 要】所有生物體均受到生物鐘的調(diào)控而產(chǎn)生行為和生理的節(jié)律變化，運(yùn)動(dòng)行為節(jié)律是反應(yīng)生物節(jié)律的最可靠標(biāo)志。斑馬魚是研究行為學(xué)的良好模式動(dòng)物。為了探討斑馬魚幼魚在持續(xù)黑暗或者持續(xù)光照條件下的行為節(jié)律方法，選擇發(fā)育至5 dpf （受精后天數(shù)）的幼魚，放置于諾達(dá)思行為分析儀中，分別采取持續(xù)弱光（DD，30 lux）、持續(xù)光照（LL，300 lux）以及正常光照黑暗（LD，14小時(shí)光：10小時(shí)暗）三個(gè)光照條件，檢測(cè)斑馬魚幼魚連續(xù)三天的運(yùn)動(dòng)行為變化。結(jié)果顯示斑馬魚幼魚在正常光暗條件下顯示出明顯的晝夜節(jié)律，即光照時(shí)運(yùn)動(dòng)多，黑暗時(shí)運(yùn)動(dòng)少。而在兩個(gè)持續(xù)條件下均表現(xiàn)出明顯的生物鐘節(jié)律，并且統(tǒng)計(jì)算出的周期均在24小時(shí)左右。但是持續(xù)光照條件（LL）下的平均運(yùn)動(dòng)距離要明顯高于持續(xù)弱光條件（DD）。因此，通過本實(shí)驗(yàn)建立起可靠的斑馬魚幼魚行為節(jié)律分析方法，為今后以斑馬魚為模型研究不同光暗條件下生物鐘行為提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】斑馬魚；生物節(jié)律；行為學(xué)

中圖分類號(hào)： R965 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 2095-2457（2018）30-0136-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.30.058

Establishment of the Circadian Behavioral Method in Zebrafish Larvae

ZHENG Yanwen， CAI Jing， ZHONG Zhaomin

（Soochow University， Suzhou Jiangsu 215123， China）

【Abstract】All organisms show daily rhythms in behaviour and physiology， and are regulated by the circadian clock. The activity behaviour have been shown to be a reliable marker for ciracdian rhythms. In recent times zebrafish have proven to be a good model system for behavioural studies. In the present study we examined the activity rhythms under different light conditions， such as light-dark cycle （LD） and constant darkness （DD） or light （LL）， in zebrafish. For this， 5 dpf （days after fertilization） larvae were placed into 48 well plate， continous videos were recorded， tracked and analyzed using Noldus behavioral apparatus under normal light-dark cycle （14 h light： 10 h dark）， constant dim light （30 lux） and constant bright light （300 lux）. We measured the changes in locomoter activity for three consecutive days. The results showed that the zebrafish showed synchronised daily rhythms in activity behaviour under light-dark cycle with a diurnal pattern， active during the day and rest during the night. Interestingly， in both LL and DD， the activity behaviour showed circadian pattern with period of ～24 hours. However， the activity was significantly higher under LL， compared to DD condition， which we reason as a direct effect of bright light on the behaviour. This sets a reliable method for analyzing the activity rhythms of zebrafish and established zebrafish as a good model to study circadian rhythms under different light conditions.

【Key words】Zebrafish； Circadian rhythm； Behavior

生物節(jié)律（生物鐘）是指生物體為了適應(yīng)由于地球自轉(zhuǎn)引起的晝夜變化而形成的行為、代謝、免疫等多方面的以大約24小時(shí)為周期的節(jié)律變化過程[1]。生物節(jié)律的變化影響到包括人類在內(nèi)的絕大多數(shù)生物的多種生理功能。2017年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的獲得者主要研究領(lǐng)域即是果蠅的生物鐘行為[2]。這也凸顯了生物鐘研究的重要性。

傳統(tǒng)的生物鐘研究模式動(dòng)物主要是小鼠和果蠅，但近些年斑馬魚領(lǐng)域多種遺傳學(xué)手段出現(xiàn)使得斑馬魚也成為研究生物節(jié)律的優(yōu)良模型[3]。斑馬魚為晝行性動(dòng)物，因此同小鼠相比，與人類的晝夜節(jié)律行為更相近；并且作為脊椎動(dòng)物模型，同果蠅相比與人類的親緣關(guān)系更近；生物節(jié)律的主要控制器在大腦，斑馬魚產(chǎn)卵量高、胚胎體外發(fā)育、易于顯微注射及胚胎透明的特點(diǎn)，研究者可以很好的利用遺傳學(xué)手段研究斑馬魚幼魚大腦的功能，并且可以進(jìn)行快速、大規(guī)模的活體藥物篩選[3]。

行為節(jié)律是反應(yīng)動(dòng)物體生物節(jié)律的最明顯的特征，在人類、小鼠及果蠅等物種中，持續(xù)黑暗條件下的行為節(jié)律還能保持近24小時(shí)的周期，并持續(xù)數(shù)天[4]。但是利用斑馬魚研究行為節(jié)律的報(bào)道卻非常少。為了更好的利用斑馬魚作為研究行為節(jié)律的模型，本研究分析了斑馬魚幼魚在多個(gè)光暗條件下的行為表現(xiàn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 動(dòng)物

6-12月齡TUBABC品系野生型斑馬魚成魚，飼養(yǎng)于蘇州大學(xué)生物鐘研究中心。采用專業(yè)的飼養(yǎng)系統(tǒng)（上海海圣工貿(mào)有限公司）進(jìn)行飼養(yǎng)，水溫維持在28.5±1℃，pH為7.2-7.6之間，魚房的光照周期為14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗，即14L：10D，每天早晚喂食豐年蝦，中午喂食干飼料。

1.2 斑馬魚胚胎及幼魚的獲得

第一天晚上將一對(duì)斑馬魚成魚放置于交配盒中，中間用擋板將雌雄分開。第二天魚房燈亮后將擋板抽掉，一小時(shí)后收集胚胎，胚胎放置于E3培養(yǎng)液中，并加入少量甲基纖維素。將未受精胚胎挑出后，剩余胚胎放置于魚房光暗條件（14L：10D，300 lux），28.5℃培養(yǎng)。待斑馬魚幼魚發(fā)育至5 dpf（受精后天數(shù)，days post fertilization）時(shí)放于行為儀中。

1.3 幼魚行為

實(shí)驗(yàn)儀器為斑馬魚行為分析儀（Noldus Information Technology）。儀器內(nèi)有紅外高速攝像頭，可捕捉每個(gè)孔的幼魚運(yùn)動(dòng)參數(shù)。將5dpf斑馬魚幼魚放置于48孔板中，每個(gè)孔放置一條幼魚。每個(gè)孔及孔與孔之間的間隙均加滿水，但液面需要保持水平，不要凸出來，保證實(shí)驗(yàn)中水分蒸發(fā)較慢，并且每個(gè)孔里的幼魚不能游到其他孔中。每個(gè)孔加入200μl的草履蟲液體，去掉48孔板的蓋子，將孔板放入行為儀中。選擇儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)功能，分別采取持續(xù)弱光（DD，30lux）、持續(xù)正常光照（LL，300lux）以及正常光照黑暗（LD，14小時(shí)光：10小時(shí)暗）三個(gè)光照條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為連續(xù)三天即5dpf-8dpf。

1.4 結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析

斑馬魚行為分析儀捕獲的數(shù)據(jù)先用系統(tǒng)自帶的分析軟件進(jìn)行分析（Ethovision 10.0 software ，Noldus Information Technology），數(shù)據(jù)的獲取均使用10分鐘作為時(shí)間間隔。生成的數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。再使用Matlab軟件采用非線性最小二乘最小化方法（nonlinear least-squares minimization method）分析其節(jié)律周期和振幅。

2 結(jié)果

2.1 三種光照條件下的行為及平均活動(dòng)量比較

在持續(xù)弱光（DD）和持續(xù)光照（LL）條件下的幼魚行為均表現(xiàn)出明顯的節(jié)律性，即相對(duì)的白天活躍，相對(duì)的晚上運(yùn)動(dòng)較少（圖1A， B）。在連續(xù)三天的檢測(cè)時(shí)間內(nèi)，兩個(gè)條件下的行為結(jié)果均有三個(gè)波峰及三個(gè)波谷，證明為近24小時(shí)的周期節(jié)律（圖1A， B）。而在正常光暗（LD）條件下，幼魚的活動(dòng)與是否有光呈明顯相關(guān)性，有光時(shí)活動(dòng)要顯著高于無光時(shí)的活動(dòng)量（圖1C）。分別統(tǒng)計(jì)LD條件下的白天（L）及夜晚（D）行為，并且與DD及LL條件下的平均活動(dòng)量比較，結(jié)果表明DD條件下的平均活動(dòng)量最低，LD條件下的黑暗時(shí)間的活動(dòng)量其次，然后是LL條件下的平均活動(dòng)量，LD條件下的白天活動(dòng)量最高（圖1D）。

2.2 持續(xù)弱光（DD）及持續(xù)光照（LL）條件下的周期及振幅比較

經(jīng)過分析LL條件下周期為23.35±0.11小時(shí)，DD條件下的周期為23.58±0.10小時(shí)，均為近24小時(shí)的周期節(jié)律。LL條件下的相對(duì)振幅1.05±0.03，DD條件下為1.16±0.03。

圖1三種光暗條件下的行為變化及平均活動(dòng)量比較。（A）持續(xù)弱光（30lux，DD）條件下的行為節(jié)律。（B）持續(xù)光照（300lux，LL）條件下的行為節(jié)律。（C）正常光暗（LD）條件下的行為變化。（D）三種條件下的平均活動(dòng)量比較。數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

3 結(jié)論

通過本實(shí)驗(yàn)很好的建立起了斑馬魚幼魚的行為節(jié)律方法。無論是持續(xù)黑暗還是持續(xù)光照條件下，斑馬魚幼魚均表現(xiàn)出明顯的節(jié)律行為，并且周期均在24小時(shí)左右。另外利用正常光暗條件實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)光照或黑暗時(shí)斑馬魚幼魚的活動(dòng)量差異。本研究為今后以斑馬魚為模型研究生物鐘行為提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]安揚(yáng)，徐瓔.哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律機(jī)制研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2015，27（11）：1372-1379.

[2]Wang， H. Perfect timing： A Nobel Prize in Physiology or Medicine for Circadian Clocks[J].Science Bulletin， 2018， 63：398-401.

[3]仲兆民，張淑青，王晗.斑馬魚生物鐘分子遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2015，27（11）：1364-1371.

[4]梅龍，桑迪，張二荃.生物鐘研究方法綜述：追求長(zhǎng)程、實(shí)時(shí)的記錄[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2018，34（10）：1021-1029.