李敏　侯增淼　李曉穎　何越

摘 要：目的：研究重組人超氧化物岐化酶畢赤酵母基因工程菌的遺傳穩(wěn)定性。方法：基因工程菌連續(xù)傳代50次，每10代取樣保藏菌種，通過對菌株形態(tài)、菌落形態(tài)、質(zhì)粒穩(wěn)定性、目的基因的PCR鑒定，蛋白表達(dá)的SDS-PAGE鑒定來評價工程菌的穩(wěn)定性。結(jié)果：在連續(xù)傳代50代的過程中，菌株、落形態(tài)與原始工程菌相比無明顯差異，質(zhì)粒保有率高，PCR鑒定結(jié)果顯示，重組載體攜帶目的基因傳至50代未消失，SDS-PAGE結(jié)果表明，傳至50代蛋白表達(dá)量無明顯差異。結(jié)論：該工程菌有良好的遺傳穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：重組人超氧化物岐化酶；畢赤酵母工程菌；遺傳穩(wěn)定性

中圖分類號：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-2945（2018）04-0011-02

Abstract： Objective： to study the genetic stability of recombinant human superoxide dismutase Pichia pastoris. Methods： the genetically engineered bacteria were subcultured for 50 times， and the preservation strains were sampled every 10 generations. The morphology of the strain， colony morphology， plasmid stability and target gene were identified by PCR. SDS-PAGE analysis of protein expression was used to evaluate the stability of engineering bacteria. Results： there was no significant difference in the strain and colony morphology between the original engineering strain and the original engineering strain in the course of successive subculture for 50 generations. The plasmid retention rate was higher than that of the original engineering strain. The results of PCR identification showed that the plasmid retention rate was high. The result of SDS-PAGE showed that there was no significant difference in the expression of protein from the recombinant vector to the 50th generation. Conclusion： the engineering strain has good genetic stability.

Keywords： recombinant human superoxide dismutase； engineered Pichia pastoris； genetic stability

超氧化物歧化酶是生物體防御氧化損傷的一種十分重要的生物酶，具有清除體內(nèi)氧自由基的能力，能較好地抵御氧自由基和其他氧化物自由基對細(xì)胞質(zhì)膜的毒性[1]，在機(jī)體保護(hù)方面起重要作用，在醫(yī)藥與化妝品方面有很好的應(yīng)用前景。巴斯德畢赤酵母具有許多其他蛋白表達(dá)系統(tǒng)所不具備的優(yōu)點，在表達(dá)產(chǎn)物的加工、外分秘、翻譯后修飾以及糖基化修飾等方面有明顯的優(yōu)勢，現(xiàn)已廣泛用于外源蛋白的表達(dá)[2-3]。由于巴斯德畢赤酵母自身分泌的蛋白非常少，且培養(yǎng)基中不含其他蛋白，分泌的外源蛋白占了培養(yǎng)液中蛋白的絕大部分，十分有利于蛋白的分離和純化[4-6]。實驗室以pPIC9K為載體，成功將人超氧化物歧化酶基因轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母GS115，構(gòu)建了人超氧化物岐化酶畢赤酵母工程菌株GS115-9K-SOD，該實驗旨在考察工程菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

GS115-9K-SOD，由本公司構(gòu)建和保存。

1.1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)相對分子量DNA，購自Thermo Fisher Scientific；標(biāo)準(zhǔn)相對分子量蛋白質(zhì)，26632，購自Thermo Fisher Scientific；G418，購自MP BIOmedicals；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺，購自上海生化試劑撫生有限公司；酵母粉，蛋白胨，購自O(shè)xoid；YNB，購自上海偉進(jìn)生物科技有限公司。

1.1.3 儀器

PCR儀，BIO-RAD公司；垂直電泳儀DYCZ-24DN型，水平電泳儀DYCP-31DN型，北京六一儀器廠。

1.1.4 培養(yǎng)基

YPD液體培養(yǎng)基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；YPD固體培養(yǎng)基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂粉20g/L；MD培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，瓊脂粉20g/L，YNB13.4g/L，生物素（4×10-4）g/L；G418-YPD培養(yǎng)基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂粉20g/L，G4184g/L；BMGY培養(yǎng)基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB 13.4g/L，0.1mol/L pH6.0磷酸鉀緩沖液，生物素（4×10-4）g/L，甘油10g/L；BMMY培養(yǎng)基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB 13.4g/L，0.1mol/L pH6.0磷酸鉀緩沖液，生物素（4×10-4）g/L，甲醇30g/L。endprint

1.2 方法

1.2.1 菌種傳代方法

將凍存于-80℃冰箱中的第0代工程菌在室溫下自然解凍，用接種環(huán)挑取菌種在YPD平板上劃線分離單菌落，29℃恒溫培一周，挑取劃線培養(yǎng)分離的單菌落接種于3ml新鮮的YPD液體培養(yǎng)基中，29℃，220rpm，振蕩培養(yǎng)24h，取30μl轉(zhuǎn)接于3ml YPD液體培養(yǎng)基，29℃，220rpm，振蕩培養(yǎng)24h為10代，在此基礎(chǔ)上重復(fù)一次為20代，分別重復(fù)到5次為50代，第代菌種都于25%的甘油溶液中保藏。

1.2.2 菌落形態(tài)

在傳代的過程中，10、20、30、40、50代取1μl菌液于倒置顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，將各代的菌液稀釋100000倍，取100μl涂布YPD固體平板，29℃靜置培養(yǎng)3-5天，觀察菌落形態(tài)。

1.2.3 質(zhì)粒穩(wěn)定性

分別取10、20、30、40、50代的菌液1μl，稀釋50000倍，取100μl涂布MD固體平板，29℃靜置培養(yǎng)3-4天，挑取100個單菌落接種于G418平板上，29℃靜置培養(yǎng)4-6天，讀取平板上生長的菌落數(shù)，計算含質(zhì)粒菌落所占的百分?jǐn)?shù)。

1.2.4 目的基因的PCR鑒定

將各代的菌液稀釋50000倍，取100μL涂布YPD固體平板，29℃靜置培養(yǎng)2-4天，待平板長出均勻的單菌落后，用凍融法裂解菌體釋放基因組DNA，步驟如下：（1）對每一株單菌落利用接種環(huán)挑取部分菌至100μl PBS中，混勻10000r/min離心3min，棄上清；（2）液氮中冷凍5min；（3）沸水浴5min；（4）重復(fù)（2）（3）步驟兩次；（5）加入100ul PBS重懸；（6）10000r/min離心3min，收集含有基因組DNA的上清液。

以提取的基因組DNA為模板，使用設(shè)計合成的一對特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.5 工程菌的表達(dá)穩(wěn)定性SDS-PAGE鑒定

分別取0、10、20、30、40、50代的菌液3μL接種于30mLBMGY培養(yǎng)基中，29℃，210r/min，搖床培養(yǎng)48h，取10mL菌液，3000r/min，4℃離心5min，棄上清，菌體加入10mL無菌水重懸洗滌一次，3000r/min，4℃離心5min，棄上清，轉(zhuǎn)入30mL BMMY培養(yǎng)基培養(yǎng)，29℃，210r/min，搖床培養(yǎng)，每天定時補(bǔ)甲醇300μL，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)4天后，離心收集上清液，棄菌體，加入5*SDS上樣緩沖液，煮沸5min，用15%濃度的SDS-PAGE進(jìn)行電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)及質(zhì)粒穩(wěn)定性

在連續(xù)培養(yǎng)50代的過程中，通過在倒置顯微鏡的觀察可見，菌體呈飽滿的球型，并伴有芽孢出現(xiàn)，無其他變異形態(tài)出現(xiàn)。在YPD平板上培養(yǎng)50代的過程中，菌落呈光滑整齊的圓形隆起，乳白色，邊緣均勻整齊，濕潤，無雜菌生長。

本文考察了50代的質(zhì)粒穩(wěn)定性，在傳代50代的過程中質(zhì)粒保有率仍可達(dá)100%，說明在有選擇壓力的培養(yǎng)基中傳代，質(zhì)?？梢苑€(wěn)定的保留。

2.2 目的基因的PCR鑒定

以每代提取的基因組DNA為模板，用一對特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，各代均在500bp左右有一清晰條帶，大小與目的片段相符，且10-50代結(jié)果與0代一致。

2.3 表達(dá)穩(wěn)定性SDS-PAGE鑒定

各代菌種在誘導(dǎo)表達(dá)后，對發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測，電泳結(jié)果如圖2所示，在18KDa左右有一明顯的表達(dá)蛋白條帶，其大小與目的蛋白理論值基本一致，且表達(dá)量10-50代與0代差異不大。

3 結(jié)束語

基因工程菌的遺傳穩(wěn)定性直接影響重組蛋白的表達(dá)，分離純化，乃至后期的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，本公司通過對構(gòu)建的重組人超氧化物岐化酶基因工程菌傳代50代內(nèi)的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行考察，結(jié)果表明：菌種在傳代50代的過程中，菌株形態(tài)、菌落形態(tài)均無明顯改變，重組質(zhì)粒穩(wěn)定，保有率高，無缺失或變異現(xiàn)像發(fā)生，目的蛋白表達(dá)量也具有良好的穩(wěn)定性，為后面大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)提供了有利保障。

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