官雪芳，鄭 怡，徐慶賢，錢 蕾，林 斌

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福州 350001)

嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)是乳品發(fā)酵工業(yè)中重要的菌種[1]，全球每年消費(fèi)的嗜熱鏈球菌乳制品市場(chǎng)價(jià)值約為400億美元[2],是公認(rèn)的食品級(jí)安全性菌株(Generally recognized as safe, GRAS)。該菌已被衛(wèi)生部列為可用于食品的菌種名單(衛(wèi)辦監(jiān)督發(fā)[2010]65號(hào))，同時(shí)也被列入國食藥監(jiān)注[2005]第202號(hào)發(fā)布的可用于保健食品的益生菌名單中，是兼具食品和保健性質(zhì)的多功能益生菌。

嗜熱鏈球菌在發(fā)酵前期可以產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)雙乙酰，在牛乳發(fā)酵及后熟過程中代謝產(chǎn)生胞外多糖[3]、細(xì)菌素和維生素[4]；其代謝產(chǎn)生的乳酸、甲酸、CO2等物質(zhì)可刺激嗜酸乳桿菌的生長[5]，同時(shí)與保加利亞桿菌之間存在互生關(guān)系，在牛乳乳制品的生產(chǎn)中，該菌常作為引子與保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)混合發(fā)酵生產(chǎn)酸奶以提高發(fā)酵乳品質(zhì)、風(fēng)味[6]及營養(yǎng)價(jià)值。

在熱及低溫殺菌的乳制品中能發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌的存在,有些馴化菌能夠在人體內(nèi)耐受胃酸和膽鹽，并且可抑制腸道致病菌[4，7-8]，有利于腸道有益菌群的建立；同時(shí)可通過菌體同化作用、吸收和吸附、有機(jī)酸產(chǎn)物代謝等方式對(duì)膽固醇起到很好的降解作用[9-11]；此外，該菌還可在牛乳中生長時(shí)將無色的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)還原為紅色三苯甲瓚而作為指示菌, 有利于牛乳中抗生素的殘留檢測(cè)[4]。

酸奶的風(fēng)味及營養(yǎng)價(jià)值與使用的乳酸菌種類密切相關(guān)，獲得優(yōu)質(zhì)的乳酸菌菌種是發(fā)酵調(diào)配優(yōu)質(zhì)酸奶最核心的技術(shù)，因此篩選優(yōu)質(zhì)的酸奶發(fā)酵乳酸菌菌種一直是研究的熱點(diǎn)?；谑葻徭溓蚓囊陨咸匦?，本研究致力于篩選能單獨(dú)發(fā)酵或與實(shí)驗(yàn)室自有的酸奶發(fā)酵菌植物乳HLX37混合發(fā)酵生產(chǎn)酸奶的嗜熱鏈球菌，為提高酸奶的品質(zhì)、風(fēng)味及益生價(jià)值提供新的發(fā)酵菌源。

1 材料與方法

1.1 材 料

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所微生物能源與環(huán)保實(shí)驗(yàn)室自然發(fā)酵產(chǎn)生的具有酸奶風(fēng)味的酸奶發(fā)酵液，鮮牛奶(福建長富乳業(yè)集團(tuán))。

1.2 主要試劑和儀器

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)。引物F(9-27)、R1525-1542(上海生工生物工程有限公司)，2×TaqPCR Master Mix(天根生化科技(北京)有限公司)，Eppendorf AG PCR儀器(艾本德中國有限公司)，Cary-50型紫外可見分光光度計(jì)(美國瓦里安技術(shù)中國有限公司)，YS100型顯微鏡(尼康儀器(上海)有限公司)，JSM-6380LV掃描電鏡(日本電子公司)，Alphalmager EP凝膠成像系統(tǒng)(Alpha innotech Corporation),Neofuge 15R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(力康發(fā)展香港有限公司)，生化培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，QYC-200型恒溫?fù)u床(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，酸奶發(fā)酵機(jī)(北京日創(chuàng)電器有限公司)，HT7700透視電鏡(日立高新技術(shù)公司)。

1.3 培養(yǎng)基制備

MC培養(yǎng)基(1 L)：大豆蛋白胨5.0 g，牛肉粉3.0 g，酵母粉3.0 g，葡萄糖20.0 g，乳糖20.0 g，碳酸鈣10.0 g，瓊脂20.0 g，中性紅0.05 g。制法：將前面7種成分加入蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至6.0，加入中性紅混合均勻，定容至1 L,分裝后121 ℃高壓滅菌20 min。固體培養(yǎng)基在這基礎(chǔ)上加瓊脂粉20.0 g。

鮮牛奶：115 ℃高壓滅菌 20 min。

LB培養(yǎng)基(1 L)：胰蛋白胨 10.0 g，氯化鈉 10.0 g，酵母浸出汁 5.0 g，瓊脂 20.0 g， pH調(diào)至7.5。

1.4 乳酸菌的篩選

參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 4789.35-2010)中嗜熱鏈球菌計(jì)數(shù)法，采用MC培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基，以自然發(fā)酵酸奶為樣品，從中吸取1 mL 自然發(fā)酵乳，分別稀釋10-5、10-6、10-7次方，各取0.1 mL涂布于含有MC固體培養(yǎng)基的平板上，待稀釋液被平板吸收后，采用限制高溫生長方法[12]，50 ℃倒置培養(yǎng)24 h，挑選出疑似嗜熱鏈球菌的暗紅色單菌落，分別在MC固體平板上劃線純化培養(yǎng)3次，同時(shí)各挑一單菌落于MC液體培養(yǎng)基中42 ℃靜置培養(yǎng)24 h,各取1 mL發(fā)酵菌液，分別接種入100 mL的鮮奶中，42 ℃發(fā)酵24 h，以鮮奶發(fā)酵凝固成固體并產(chǎn)生清香味為指標(biāo)，挑選出達(dá)到這一指標(biāo)的菌種，保存。繼續(xù)將菌株分別接入鮮奶中反復(fù)接種，于42 ℃發(fā)酵培養(yǎng)5次，觀察鮮奶發(fā)酵凝固成固體所需的時(shí)間，同時(shí)感官評(píng)價(jià)發(fā)酵酸奶的風(fēng)味口感，挑選出1株能在42 ℃發(fā)酵10 h時(shí)使鮮奶發(fā)酵凝固成固體酸奶、風(fēng)味口感最佳的疑似嗜熱鏈球菌菌株，保存并命名為LCM46。

1.5 菌株LCM46的鑒定

1.5.1 菌株的形態(tài)觀察 對(duì)菌體進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、電子顯微鏡觀察菌體革蘭氏染色形態(tài)、JSM-6380LV掃描電鏡及HT7700透視電鏡觀察菌體形態(tài)。

1.5.2 生理生化特征的鑒定 參照《伯杰細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(第8版)[12]。

1.5.3 16S rDNA序列分析 細(xì)菌基因組DNA的提取:采用TIANGEN公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取。16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增及測(cè)序：擴(kuò)增16S rDNA基因，所用引物為F(9-27):5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R1525-1542:5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGC- C-3′。 PCR反應(yīng)體系:2×Mix 12.5μL,引物及DNA各1.0 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增程序： 93 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃充分延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆后進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序委托鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司完成。

1.5.4 PCR產(chǎn)物檢測(cè)及測(cè)序分析 取5 μL的PCR產(chǎn)物，在加入EB的0.01 g/mL瓊脂糖凝膠中電泳分離,將含有目標(biāo)片段的產(chǎn)物測(cè)序。將測(cè)得的序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，同時(shí)在該數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析。

1.5.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 將測(cè)得的16S rRNA序列用NCBI的Blast程序進(jìn)行序列同源性比對(duì)，用MEGA 4．1軟件中的Maximum Parsimony方法構(gòu)建基于16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 菌株LCM46微生物學(xué)特性研究

嗜熱鏈球菌母液制備：取φ=20%甘油保存的LCM46 100 μL接種于100 mL的MC液體培養(yǎng)基中，37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h,制成菌種母液，備用。

1.6.1 最適酸奶發(fā)酵時(shí)間的測(cè)定 取嗜熱鏈球菌母液(下同)1 mL接種于含100 mL鮮牛奶(含0.08 g/mL蔗糖，105 ℃高壓滅菌40 min)的發(fā)酵瓶中，置于酸奶機(jī)中42 ℃分別靜置發(fā)酵10、11、12、13、15、17、34 h,制成酸奶制品，測(cè)定酸奶酸度(滴定法:GB5409-85)及嗜熱鏈球菌落數(shù)。

1.6.2 生長曲線測(cè)定 取嗜熱鏈球菌母液各100 μL分別接種于75管裝有10 mL MC液體培養(yǎng)基的試管中，37 ℃靜置發(fā)酵培養(yǎng)，以未接菌的培養(yǎng)基為對(duì)照，分別在發(fā)酵后1～96 h的不同時(shí)間段內(nèi)取3管測(cè)定菌體OD600值。

1.6.3 最適發(fā)酵溫度的測(cè)定 取嗜熱鏈球菌母液各100 μL分別接種于裝有10 mL MC液體培養(yǎng)基的試管中，于10、20、30、40、50和60 ℃靜置發(fā)酵培養(yǎng)24 h,測(cè)定發(fā)酵液OD600，依據(jù)以上結(jié)果，以同樣的方法，設(shè)計(jì)溫度32.5、35、37.5、40.0和42.5 ℃，獲得精確的最適發(fā)酵溫度。

1.6.4 最適發(fā)酵pH的測(cè)定 取嗜熱鏈球菌母液各100 μL分別接種于裝有10 mL不同pH的MRS液體培養(yǎng)基的試管中，37 ℃靜置發(fā)酵培養(yǎng)24 h,測(cè)定發(fā)酵液OD600值。

1.6.5 耐酸測(cè)定 取LCM46母液1 mL接種菌種于不同pH(pH梯度為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0) 的10 mL MC液體培養(yǎng)基，42 ℃分別培養(yǎng)0、2、4 h，每一處理3個(gè)重復(fù)。各取1 mL樣品菌液于9 mL生理鹽水中混勻，制備10-3個(gè)稀釋度溶液，取0.1 mL稀釋液于MC中涂布， 42 ℃ 倒置培養(yǎng)48 h(每個(gè)處理3個(gè)平行)，計(jì)算平板上的菌數(shù)。

1.6.6 菌株的黏附能力測(cè)定 培養(yǎng)嗜熱鏈球菌(MC液體培養(yǎng)基)、大腸桿菌DH5α(LB液體培養(yǎng)基)24 h得發(fā)酵液，分別于3 000 r/min、4 ℃下離心10 min，收集菌泥，依次用pH 7.0的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌菌泥2次(即在菌落中加入PBS，震蕩混合均勻后，置于3 000 r/min、4 ℃下離心10 min，收集菌體)。自凝集率：用無菌的PBS將菌泥HLX37制成在波長600 nm處的吸光值為0.4±0.1(A0)的懸浮菌液，靜置24 h后測(cè)定吸光值A(chǔ)24，自凝集率=(A0-A24)/A0×100%。他凝集率：將HLX37和大腸桿菌DH5α的懸菌液調(diào)節(jié)成在波長600 nm處的吸光值為0.6±0.1(A0)的混合懸浮菌液。靜置24 h后測(cè)定吸光值A(chǔ)24，他凝集率=(A0-A24)/A0×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似嗜熱鏈球菌的獲得

在50 ℃ MC固體培養(yǎng)基平板上，挑選出疑似嗜熱鏈球菌的暗紅色單菌落15個(gè)，其中能在42 ℃發(fā)酵24 h使鮮奶發(fā)酵凝固成固體并產(chǎn)生清香味的菌株有5株，反復(fù)接種5次后，最終挑選出1株能在42 ℃發(fā)酵10 h時(shí)使鮮奶發(fā)酵凝固成固體酸奶、通過感官品評(píng)獲得的風(fēng)味口感最佳，產(chǎn)生酸奶質(zhì)地粘稠的乳酸菌菌株，保存并命名為LCM46。

2.2 菌種的鑒定

2.2.1 菌株LCM46的形態(tài)觀察 LCM46菌株的主要形態(tài)特征如下：菌落圓，光滑，在MC培養(yǎng)基上呈暗紅色、不透明，革蘭氏陽性，菌體橢圓，寬0.7～0.9 μm,長0.8～1.9 μm，成對(duì)到長鏈(圖1)。

2.2.2 生理生化特征的鑒定 LCM 46菌株生理生化特征見表1，具體為：VP試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)和奈試產(chǎn)氨試驗(yàn)呈陽性， MR、過氧化氫試驗(yàn)、明膠試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)顯示陰性，說明該菌能分解利用大分子含氮物質(zhì)，能產(chǎn)生淀粉酶將淀粉水解為糖類物質(zhì)，能將葡萄糖分解產(chǎn)生丙酮酸，不能利用明膠。能發(fā)酵利用α-乳糖、葡萄糖、蔗糖產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣；不能利用麥芽糖、D-果糖。

A.菌落形態(tài)圖 Colony characteristics inoculated in MC medium;B.革蘭氏染色圖 Gram staining;C.掃描電鏡圖譜 Scanning electron microscopy(SEM);D.透視電鏡圖譜 Transmission electron microscope(TEM)

圖1菌株LCM46的形態(tài)
Fig.1ColonycharacteristicsandmorphologyofLCM46strain

表1 LCM46菌株的生理生化特征Table 1 Morphological and physiological characteristics of LCM46 strain

注： + 陽性;- 陰性。

Note：+. Positive; -. Negative.

2.2.3 LCM46菌的分子生物學(xué)鑒定 對(duì)菌株LCM46的16S rDNA序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖2)，并測(cè)序獲得該序列長度為1 416 bp，在NCBI數(shù)據(jù)中對(duì)該序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，得到序列Streptococcusthermophilus的序列同源性為100%，采用 MEGA 5.2中的Neighbor-joining進(jìn)行發(fā)育樹的構(gòu)建分析(圖3)，菌株LCM46與Streptococcusthermophilus對(duì)應(yīng)遺傳距離最近，結(jié)合形態(tài)觀察和生理生化試驗(yàn)，確定菌株LCM46即為嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)，序列在GenBank中申請(qǐng)得到的登錄號(hào)為KR105939。

2.3 LCM46特性研究

2.3.1 LCM46菌最適酸奶發(fā)酵時(shí)間 由圖4可知：經(jīng)菌LCM46發(fā)酵后，發(fā)酵乳的酸度最高上升至(90.65±0.17)°T，發(fā)酵到11 h時(shí)，酸度為(80.77±0.17)°T，此時(shí)的發(fā)酵乳酸甜適宜，質(zhì)地穩(wěn)定，口感脆嫩，無乳清析出，散發(fā)出清淡的酸奶清香味，酸奶質(zhì)量最佳。此時(shí)的菌落數(shù)為(11.71± 0.20)×108cfu/mL，當(dāng)發(fā)酵到17 h時(shí)，菌落數(shù)達(dá)到最大值(34.00± 0.02)×108cfu/mL，酸度亦達(dá)到(89.36±0.17)°T，之后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，菌落數(shù)迅速下降。

圖2 菌的PCR擴(kuò)增片段圖譜Fig.2 The agarose electrophoresis of 16S rDNA PCR product

圖3 菌株LCM46的系統(tǒng)發(fā)育樹圖譜Fig.3 Phyogenetic tree of LCM46 strain based on 16S rDNA sequences homology

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶酸度及菌落數(shù)影響Fig.4 Effect of fermentation time on acidity and number of LCM46 in fermented milk

2.3.2 LCM46生長曲線 由圖5可知：菌LCM46發(fā)酵到2 h時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，發(fā)酵到12 h 時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)菌體OD600值為0.55±0.00。

圖5 菌株LCM46生長曲線Fig.5 The growth curve of LCM46 strain

2.3.3 LCM46最適發(fā)酵溫度 由圖6可知：菌株LCM46最適發(fā)酵溫度為40 ℃，菌體OD600值為0.85±0.09，發(fā)酵到60 ℃時(shí)菌的OD600值降到0.17±0.01，說明該菌能在50 ℃的高溫時(shí)生長，耐受溫度亦達(dá)到60 ℃。

2.3.4 LCM46最適發(fā)酵pH 由圖7可知：LCM46菌最適發(fā)酵初始pH為6.0，菌體OD600值為0.89±0.01，當(dāng)初始pH小于4.3或大于7.5時(shí)，菌的OD600值均低于0.1，處于停滯生長狀態(tài)，說明該菌適合生長的初始pH為4.3～7.5。MC培養(yǎng)基經(jīng)LCM46發(fā)酵后，發(fā)酵菌液pH下降至3.8～5.0。說明菌LCM46具有一定的產(chǎn)酸能力。

圖6 溫度對(duì)菌LCM46生長的影響Fig.6 Effect of temperature on the growth of LCM46 strain

圖7 初始pH對(duì)菌株LCM46生長的影響Fig.7 Effect of initial pH on the growth of LCM46 strain

圖8 LCM46耐酸能力Fig.8 Acid resistant ability of LCM46 strain

2.3.5 LCM46耐酸能力 從圖8可知：隨著處理時(shí)間的增加及所處pH環(huán)境的下降，菌落數(shù)呈下降趨勢(shì)，當(dāng)pH≤4.5時(shí)，存活率均低于100%，當(dāng)?shù)陀?.0時(shí)，菌不能生長；在臨界pH=3.5,培養(yǎng)4 h后，菌落為(0.87±0.03)×105cfu/mL，存活率達(dá)63.04%±3.01%。 說明該菌有一定的耐酸能力，但酸的作用對(duì)菌的生長影響顯著。

2.3.6 菌株HLX37的黏附能力 從表2可知：菌LCM46的自凝集率為19.28%，對(duì)大腸桿菌DH5α的凝集率為12.32%，黏附能力較差。

表2 菌株LCM46黏附能力Table 2 Adhesive ability of LCM46 strain

3 討 論

在50 ℃的篩選條件下，采用MC培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基，從自然發(fā)酵酸奶中獲得1株能發(fā)酵產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)酸奶的疑似嗜熱鏈球菌，命名為LCM46，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征鑒定、16S rDNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹同源性分析，鑒定為嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)，該菌最適發(fā)酵溫度為40 ℃，耐受溫度可達(dá)到60 ℃。說明采用MC為嗜熱鏈球菌條件篩選培養(yǎng)基并配合高溫條件篩選法比較容易獲得嗜熱鏈球菌菌種。

嗜熱鏈球菌屬于鏈球菌屬(Streptococcus)，本研究獲得的嗜熱鏈球菌LCM46對(duì)數(shù)生長期為2～12 h,最大OD600只有0.55，但在以牛乳為基質(zhì)的發(fā)酵乳中，LCM46發(fā)酵到口感最佳狀態(tài)菌落數(shù)可達(dá)到(11.71±0.20)×108cfu/mL，當(dāng)發(fā)酵到17 h時(shí)，菌落數(shù)達(dá)到最大值，說明牛乳是該菌最適合生長的基質(zhì)，而MC只適合作為嗜熱鏈球菌的條件篩選培養(yǎng)基；測(cè)定菌LCM46最適發(fā)酵pH為6.0，適合生長初始pH為4.3～7.5，低于4.3時(shí)處于停滯生長狀態(tài)，處在這一酸性環(huán)境下的時(shí)間越長,菌的致死率越大，在低于3.0時(shí)，處理2 h即可全部致死。因此，在牛乳發(fā)酵中由于大量的乳糖被發(fā)酵產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì)，使得發(fā)酵乳的酸度大大提高，在發(fā)酵到34 h時(shí)，發(fā)酵乳酸度已達(dá)到(89.36± 0.17)°T(測(cè)得的pH為3.5左右)，菌落數(shù)只有(0.18±0.06)×108cfu/mL，存活率僅為0.53%，但依然超過活菌發(fā)揮功能特性的菌數(shù)臨界值(106cfu/mL)[13]，在應(yīng)用該菌生產(chǎn)發(fā)酵乳時(shí)，為避免影響活菌的數(shù)量，發(fā)酵的時(shí)間不宜過長，發(fā)酵乳的酸度不宜過低。

檢測(cè)菌LCM46的自凝集率和對(duì)大腸桿菌DH5α的凝集率分別為19.28%和12.32%，雖然黏附能力不強(qiáng)，產(chǎn)生的細(xì)胞蛋白有限，益生菌效果受到一定影響[14],但這一特性使得產(chǎn)生的發(fā)酵乳質(zhì)地脆嫩，和高黏附力的菌種混合發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵乳有希望大大改善高黏附產(chǎn)生的質(zhì)地粘稠的性狀。

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