王 信，程 亮，蔡曉劍，王亞藝，高旭升，李松齡

(1.青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院 土壤肥料研究所，西寧 810016；2.青海大學(xué) 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；3.青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，西寧 810016)

馬鈴薯是青海省的主要糧食作物，是結(jié)構(gòu)調(diào)整中重點(diǎn)發(fā)展的十大產(chǎn)業(yè)之一，而且成為青海省農(nóng)民增收的主要產(chǎn)業(yè)。2013年青海省馬鈴薯種植面積達(dá)到9.56萬hm2，總產(chǎn)量達(dá)到2 150萬t[1]，僅次于小麥和油料，成為第三大作物，主要種植于互助、民和、樂都、湟中、大通、平安等東部各縣的山區(qū)。馬鈴薯軟腐病是青海馬鈴薯生產(chǎn)的主要病害之一，該病害初期僅在局部地區(qū)發(fā)生，隨著帶病種薯的頻繁調(diào)運(yùn)，種植面積逐年擴(kuò)大，危害越來越大。因此，防治馬鈴薯軟腐病是確保青海省馬鈴薯高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，也是確保收獲的塊莖能夠安全儲藏的重要條件之一。果膠桿菌屬(Pectobacterium)病原菌是造成馬鈴薯軟腐病、莖枯萎和黑脛病以及其他寄主植物的致病菌，在作物生長、繁殖、運(yùn)輸和儲藏期間都可造成危害，引起作物經(jīng)濟(jì)損失。果膠桿菌屬系腸桿菌科的一員，和其他致病因子一樣，分泌大量的植物細(xì)胞壁降解酶，引起植物組織浸漬和水浸癥狀，感染植物組織后通常表現(xiàn)為軟腐[2-3]。果膠桿菌屬依據(jù)其寄主范圍、生理生化和分子特征，將其分為5個種，分別為軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種[Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum(Pcc) (syn.Erwiniacarotovorumsubsp.carotovorum)],黑腐果膠桿菌[P.atrosepticum(Pa) (syn.E.carotovorumsubsp.atrosepticum)],山葵果膠桿菌[P.wasabiae(Pw) (syn.E.carotovorumsubsp.wasabiae)],軟腐果膠桿菌甜菜亞種[P.betavasculorum(Pbv) (syn.E.carotovorumsubsp.betavasculorum)]和軟腐果膠桿菌巴西亞種[P.carotovorumsubsp.brasiliense(Pcb)][4]。果膠桿菌屬寄主范圍廣泛，從土壤、水體、寄主植物和節(jié)肢動物上都可以分離獲得此屬的菌株。其中Pa通常在溫帶寄主植物上存活[5]，而Pcb和Pw通常在熱帶和亞熱帶地區(qū)引起馬鈴薯軟腐病和黑脛病[6]。目前為止，果膠桿菌屬引起馬鈴薯軟腐病在中國部分地區(qū)已有報(bào)道，然而青海地區(qū)馬鈴薯軟腐病致病菌的致病性和分類鑒定鮮有報(bào)道。本研究從青海省的樂都縣、互助縣、湟中縣、大通縣和平安縣馬鈴薯生產(chǎn)田的馬鈴薯軟腐病的發(fā)病塊莖組織中分離病原菌，通過對病原菌的形態(tài)觀察、生理生化指標(biāo)測定，分析馬鈴薯軟腐病病原菌的致病性、表型特征和16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，明確青海省馬鈴薯細(xì)菌性軟腐病的病原菌種類及其生物學(xué)特征和致病力差異。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及培養(yǎng)基

馬鈴薯軟腐病標(biāo)樣采集于青海省的樂都縣、互助縣、湟中縣、大通縣和平安縣的馬鈴薯生產(chǎn)田。

結(jié)晶紫果膠酸鹽選擇性培養(yǎng)基(CVP)：在500 mL沸騰的蒸餾水中按順序加入1 mL 0.75 g/L 結(jié)晶紫溶液，4.5 mL 1 mol/L NaOH溶液，3 mL 100 g/L CaCl2·2H2O溶液(新鮮溶液)，3.0 g瓊脂粉，1.0 g NaNO3，9.0 g聚果膠酸鈉，在聚果膠酸鈉加入時(shí)人工攪拌30 s，然后分別裝入三角瓶，121 ℃滅菌20 min，趁熱將培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷卻后制成平板。

Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉10.0 g，瓊脂粉15 g，用去離子水混合定容至1 000 mL，pH 7.0。然后分別裝入三角瓶，121 ℃滅菌20 min，趁熱將培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿，冷卻后制成平板。

1.2 病原菌分離

采用常規(guī)組織分離法分離病原菌。稱取0.1 g 病塊莖置于250 mL的三角瓶中，并加入100 mL 的蒸餾水，放入玻璃珠充分打散混合液，置于120 r/min 搖床中，培養(yǎng)30 min后，充分搖勻。用1 mL無菌的吸管吸取10-2mL-1菌懸液1 mL放入9 mL的無菌水管中，吹吸 3次混勻即為10-3mL-1稀釋液，依次從10-3mL-1連續(xù)稀釋至10-7mL-1，即得一系列10倍的稀釋液。每個梯度重復(fù)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，分別涂布到CVP培養(yǎng)基上，25～27 ℃黑暗培養(yǎng)48 h，將形態(tài)典型的菌落在CVP培養(yǎng)基反復(fù)劃線，進(jìn)行純化培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行編號和保存。

1.3 致病力測定

選擇健康馬鈴薯品種‘大西洋’的塊莖用于致病性分析。將5個待測菌株于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，用無菌的9 g/L溶液洗滌3次后，配置5×108cfu/mL的菌懸液。將無病的大小均勻的塊莖用自來水沖洗后放入5 g/L NaCl溶液中洗2次，每次20 min，然后用無菌去離子水沖洗1～2次，放入超凈臺中自然晾干，用無菌竹牙簽給每個塊莖打2～3個接種孔，深度約為20 mm，用9 g/L NaCl溶液配制成5×108cfu/mL的菌懸液，取10 μL加入接種孔中，每個菌株接種10個塊莖。用凡士林將塊莖上的接種孔封口保濕，將接種的塊莖置于溫度為22 ℃、相對濕度≥92%的溫室培養(yǎng)。同等條件下，設(shè)無菌9 g/L NaCl溶液為空白對照。接種后72 h時(shí)測量病斑的直徑并取其平均值作為病斑平均直徑。按以下分級標(biāo)準(zhǔn)記錄病斑：1～5 mm為弱致病力，5～10 mm為中等致病力，10 mm以上為強(qiáng)致病力。

1.4 菌株形態(tài)和生物化學(xué)特性分析

菌落形態(tài)、革蘭氏染色和鞭毛染色、檸檬酸鹽分解及37 ℃生長測定參照《植病研究方法》(第3版)[7]進(jìn)行。病原菌對蔗糖、麥芽糖、山梨醇、阿拉伯醇、乳糖和α-甲基葡糖苷等的利用測定試驗(yàn)參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(第8版)[8]和《植病研究方法》(第3版)[7]進(jìn)行。選用青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院土壤肥料研究所農(nóng)業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)室(以后稱本實(shí)驗(yàn)室)保存的軟腐病致病菌Pa(編號:Ba11)和Pcc(編號: ECC71)為對照菌株。

1.5 16S rRNA基因片段的擴(kuò)增與序列分析

1.5.1 基因組DNA的提取 將保存于-80 ℃冰箱的菌株劃線，并于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜活化，挑取單菌落放入液體LB培養(yǎng)基中，置28 ℃培養(yǎng)16～18 h。病菌DNA的提取使用Ezup柱式SK8255試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]。取1 μL DNA溶液用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA于-20 ℃保存，備用。

1.5.2 16S rRNA片段的擴(kuò)增 應(yīng)用細(xì)菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCGGCTCAG-3′)；1942r(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。每個PCR反應(yīng)體系總體積均為25 μL，包括2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL(編號為KT201-02，Tiangen)，DNA模板(50 ng/L)1 μL，引物各1 μL，雙蒸水10.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。回收大小約1.5 kb的PCR產(chǎn)物。將其連接到pGEMT-Easy載體(Promega corp.，美國)上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。重組質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ酶切和PCR鑒定后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5.3 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 測序結(jié)果用軟件Chromas(ver.2.4.1)進(jìn)行序列修正后，在NCBI數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)Blast檢索與目標(biāo)序列同源性高的DNA序列，與本文所測菌株序列分別進(jìn)行比對。利用軟件MEGA(ver.5.05)的UPGMA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支的置信度自舉檢測(bootstrap)1 000次。

1.6 Pcc亞種特異引物擴(kuò)增基因

用Pcc特異性引物EXPCCF(5′-GAACTTCGCACCGCCGACCTTCTA-3′)和EXPCCR(5′-GCCGTAATTGCCTACCTGCTTAAG-3′)[9]擴(kuò)增5個分離菌株pECC2F序列區(qū)域。25 μL的PCR反應(yīng)體系：DAN模板1 μL(100 ng/L)，2×TaqPCR Master Mix 12 μL，上游引物1 μL(20 μmol/L)，下游引物1 μL(20 μmol/L)，加ddH2O至總體積25 μL。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。以2 000 bp DNA marker為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，取4 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，核酸染料染色觀察是否有特異性條帶產(chǎn)生。選用本實(shí)驗(yàn)室保存的果膠桿菌致病菌Pa(Pa11)為對照菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟腐病菌的分離和致病性測定

軟腐病病樣中分離的菌株經(jīng)CVP選擇性培養(yǎng)基篩選，選擇在CVP培養(yǎng)基上生長的菌株向培養(yǎng)基內(nèi)部擴(kuò)展，形成杯狀凹陷(圖1-A)，將分離的菌株回接到宿主馬鈴薯塊莖上，塊莖組織從接種部位開始產(chǎn)生水漬狀病變并向接種點(diǎn)周圍迅速擴(kuò)散(圖1-B)。其癥狀于田間采集的馬鈴薯軟腐病樣癥狀一致，對接種發(fā)病的馬鈴薯塊莖組織重新分離病原菌，得到的5個菌株均能引起馬鈴薯塊莖軟腐癥狀。

2.2 軟腐病菌的形態(tài)及生物化學(xué)特征分析

軟腐病病樣中分離的5個菌株經(jīng)CVP選擇性培養(yǎng)基篩選，在CVP培養(yǎng)基上產(chǎn)生凹陷的菌株。將菌株轉(zhuǎn)接到LB固體培養(yǎng)基上，菌落形態(tài)呈圓形、乳白色、表面光滑，略隆起。革蘭氏染色呈陰性。所有測試菌株均可在37 ℃生長，具有耐鹽性，對紅霉素不敏感，能使明膠液化，過氧化氫酶反應(yīng)呈陽性，蔗糖試驗(yàn)還原反應(yīng)、氧化酶和磷酸酶活性及吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)均呈陰性，不能利用D-麥芽糖、山梨醇、D-阿拉伯糖醇和α-甲基葡萄糖，但可以利用檸檬酸鹽、乳糖、纖維二糖、棉子糖和蜜二糖(表1)，這些結(jié)果與報(bào)道的胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種(P.carotovorumsubsp.carotovorum)的生物學(xué)形態(tài)特征和生理生化特性均吻合[4]。

圖1 菌株在CVP培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生杯狀凹陷(A)和接種48 h后塊莖癥狀(B)Fig.1 Cup-shaped cavities formation of isolated pathogen from diseased tuber of potato in field on CVP agar (A) and symptom of healthy tuber at 48 h after in vitro-inoculation with pathogen (B)

2.3 16S rRNA的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

分離獲得的5個菌株QPB-4、QLL-10、QDM-7、QHX-4和QHL-2的16S rRNA基因經(jīng)PCR擴(kuò)增，均得到一條大小約為1.5 kb的片段(圖2)，與胡蘿卜軟腐病果膠桿菌16S rRNA基因的擴(kuò)增片段大小近似，在NCBI數(shù)據(jù)庫中將測序結(jié)果與已知序列進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明，5個菌株與Pcc(KR054976.1)的16S rRNA基因序列的相似度(或一致性)均達(dá)99%。基于16S rRNA基因完整序列，以馬鈴薯黑脛病致病菌(Dickeyasolani)菌株ND14b為外組，將5個菌株的序列與已發(fā)表的38株軟腐菌菌株的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果顯示，本研究分離得到的5個菌株與已發(fā)表的Pcc菌株形成的類群構(gòu)成明顯的分枝，已發(fā)表的Pcb與Pco菌株形成的類群構(gòu)成獨(dú)立的分枝，Pa和Pb菌株共同組成的類群與Pw菌株組成的類群也聚集成另外分枝。

2.4 Pcc特異性引物擴(kuò)增

用Pcc特異性引物EXPCCF和EXPCCR擴(kuò)增5個菌株及其對照菌株。結(jié)果表明5個菌株中均擴(kuò)增得到一條大小約為550 bp的特異性條帶(圖4)；而在對照菌株P(guān)cb(BC1)中沒有得到擴(kuò)增產(chǎn)物，由此可見，分離的5個菌株均被鑒定為Pcc。

表1 從田間病薯塊莖分離的5個菌株的生理生化特征Table 1 Physiochemical characteristics of 5 strains isolated from diseased tubers of potato plants in field

注：+.陽性反應(yīng)；-.陰性反應(yīng)。

Note：+ and - indicate positive and negative reactions.

M.DNA marker DL2000；1.無菌水用作陰性對照 Sterile water used as negative control;2.菌株QPB-4 Strain QPB-4；3.菌株QHL-2 Strain QHL-2;4.菌株QDM-7 Strain QDM-7; 5.菌株QLL-10 Strain QLL-10;6.菌株QHX-4 Strain QHX-4

圖2不同分離菌株16SrRNAPCR的瓊脂糖凝膠電泳
Fig.2Ethidiumbromide-stainedagarosegelelectrophoresisshowingPCRproductsamplifiedin16SrRNAgenesofdifferentstrains

2.5 軟腐病菌致病力測定

以馬鈴薯塊莖接種病原菌產(chǎn)生的病斑長度作為判定細(xì)菌的致病力。塊莖竹簽傷口接種后72 h時(shí)統(tǒng)計(jì)病斑長度，發(fā)現(xiàn)5個菌株之間不存在明顯的致病力差異，按病斑長度劃分為低、中和高等致病力。Pcc亞種之間的菌株致病力不存在差異，菌株QPB-4、QHX-4、QDM-7和QLL-10在接種后72 h時(shí)表現(xiàn)較強(qiáng)致病力，而菌株QHL-2表現(xiàn)為中等致病力。同時(shí)來自不同地區(qū)的菌株致病力差異也不顯著(表2)。

3 結(jié)論與討論

支點(diǎn)上的數(shù)字為 Bootstrap 生成的百分率，條形圖表示遺傳距離 The number at each branch points showed percentage supported by Bootstrap,bar indicated the genetic distance of evolutionary branches

圖35個菌株與其他菌株的16SrRNA基于序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.3Phylogenictreebasedonblastresultsof5strainsPectobacterium16SrRNAsequence

表2 5個Pcc菌株的采集地點(diǎn)及致病力等級Table 2 Sampling sites and pathogencity level of 5 Pcc strain collections

注：M.致病力中等；H.高致病力。

Note： M.moderate pathogenicity;H.high pathogenicity.

M.DNA marker DL2 000；1.無菌水用作陰性對照 Sterile water used as negative control; 2.菌株QPB-4 Strain QPB-4；3.菌株QHL-2 Strain QHL-2;4.菌株P(guān)a(Pa11) Strain Pa(Pa11); 5.菌株QLL-10 Strain QLL-10;6.菌株QHX-4 Strain QHX-4; 7.菌株QDM-7 Strain QDM-7

圖4分離的5個不同菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳
Fig.4Ethidiumbromide-stainedagarosegelelectrophoresisofPCRproductsamplifiedfrom5differentstraincollections

Pcc是自然條件下寄主種類眾多和地理分布最為廣泛的植物病原菌，能浸染溫帶和亞熱帶地區(qū)種植的馬鈴薯、白菜、甘藍(lán)、胡蘿卜、番茄、洋蔥、芹菜和黃瓜等數(shù)百種蔬菜，以及某些花卉植物，如馬蹄蓮、菊花、蘭花、蝴蝶蘭和君子蘭等[2]。馬鈴薯軟腐病是馬鈴薯生產(chǎn)上的重要病害之一，近年由于青海不斷擴(kuò)大馬鈴薯種植規(guī)模，軟腐病在青海省的發(fā)生范圍也蔓延擴(kuò)大。本研究通過對青海省馬鈴薯軟腐病的病原菌分離、形態(tài)觀察、致病性測定及16S rDNA基因序列比較，明確引起青海省馬鈴薯軟腐病的病原為胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum)。該亞種引發(fā)馬鈴薯軟腐病，此后導(dǎo)致西椒、胡蘿卜和萬年青植物的軟腐病，也有巴西、摩洛哥等國家馬鈴薯軟腐病來源于該菌系[10-15]。5個菌株的形態(tài)表型特征與果膠軟腐桿菌(Pectobacterium)相似。進(jìn)一步測定該病原菌的生理生化特征，包括過氧化氫酶、氧化酶產(chǎn)生、明膠液化、蔗糖還原、磷酸酶活性、吲哚產(chǎn)物、對紅霉素的敏感性、碳水化合物產(chǎn)酸、有機(jī)鹽產(chǎn)酸、37 ℃生長及50 g/L NaCl溶液中的生長情況，與胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種(Pcc)特征完全一致[4]。不同于Pa與Pw菌系低于36～37 ℃的生長特性，又有別于Pb菌系不能利用檸檬酸和明膠的特性，5個菌株與參試菌株P(guān)all均可以在37 ℃和5 g/L NaCl培養(yǎng)基中正常生長，具備降解檸檬酸和明膠特征，這與Pc菌株表現(xiàn)一致，支持其屬于Pc種的歸類[16-18]。

DNA標(biāo)記、血清學(xué)和DNA 雜交在許多植物病原細(xì)菌致病亞種和致病型區(qū)分方面有報(bào)道，其中16S rRNA序列分析是目前主要的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分類方法[19]。為了進(jìn)一步明確病原菌的亞種分類地位，對測試菌株的基因組進(jìn)行分析。通過對16S rRNA基因序列分析，結(jié)合Pcc亞種pECC2F序列特異性引物擴(kuò)增，將分離得到的5個軟腐病菌均鑒別為Pcc。16S rRNA基因完整的序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果將分離得到的5個軟腐菌與已發(fā)表的Pcc菌系共同形成明顯的Pcc分支，且該分支中與Pco和Pcb歸為不同類群；利用Pcc亞種pECC2F序列的特異性引物在Pcc菌系中均擴(kuò)增出1條大小約550 bp的Pcc特異條帶，而Pcb菌株無擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，EXPCC特異性引物擴(kuò)增方法也可用于Pcb亞種的鑒定[20]。Onkendi等[21]報(bào)道用EXPCCF/EXPCCR特異性引物在Pcc菌系中擴(kuò)增得到550 bp的特異性條帶，而Pcb中無擴(kuò)增產(chǎn)物。Nabhan等[18]研究認(rèn)為16S rRNA僅能區(qū)分細(xì)菌種的差異，而不能對亞種進(jìn)行區(qū)分，但本研究在5個Pcc菌株中，有2個Pcc菌株與已發(fā)表的Pcc菌系聚集成由Pcc菌株構(gòu)成的亞類群，而遺傳關(guān)系相對較遠(yuǎn)的Pco和Pcb菌株單獨(dú)成群。可見，基于16S rRNA基因序列在一定程度上也揭示亞種之間的遺傳關(guān)系。

本研究致病力鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個菌株不存在明顯的致病力差異，亞種內(nèi)不同地區(qū)的菌株之間也不存在明顯的致病力分化。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，馬鈴薯細(xì)菌性軟腐病多為Pcc亞種所致[10，12，22-24]。但本研究在青海省其他地區(qū)馬鈴薯軟腐病病樣中也分離到Pcb和Pco，用該亞種接種馬鈴塊莖莖亦能引起植株塊莖軟腐癥狀，但接種馬鈴塊莖莖軟腐程度不同，并且Pcb和Pco菌株占分離菌株的比例不高。因此引起青海省馬鈴薯軟腐病的病原主要是Pcc。關(guān)于Pcc與Pcb、Pco二者或三者在青海春種馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的分布、擴(kuò)散及復(fù)合浸染有待進(jìn)一步研究。

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