劉 潮，韓利紅，王海波，唐利洲

(曲靖師范學(xué)院 云南高原生物資源保護(hù)與利用研究中心，生物資源與食品工程學(xué)院，云南省高校云貴高原動植物多樣性及生態(tài)適應(yīng)性進(jìn)化重點實驗室，云南曲靖 655011)

病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis related protein，PR)是植物受病原物侵染或非生物因子刺激后產(chǎn)生的一類水溶性蛋白。目前，發(fā)現(xiàn)至少17個PR家族[1]。類甜蛋白(Thaumatin like protein，TLP)屬于PR5家族，因與熱帶植物西非竹竽(ThaumatococcusdanielliBenth.)果實中分離到的甜蛋白(Thaumatin)氨基酸序列有很高的同源性而得名，廣泛分布于多種植物、動物及微生物中[2-3]。典型的TLP由16個半胱氨酸殘基對形成8個二硫鍵，不僅穩(wěn)定了分子結(jié)構(gòu)，也保證蛋白的正確折疊，能夠抵抗熱變性、酸、堿和蛋白酶降解作用[4-5]。大多數(shù)TLP均具有索瑪甜家族標(biāo)簽和5個保守的氨基酸殘基[6]，后者參與蛋白維持適當(dāng)?shù)耐負(fù)浣Y(jié)構(gòu)和酸裂周圍的表面靜電勢，對TLPs抗真菌活性必不可少[7]。TLP家族蛋白進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，動物TLP單獨分在一支，并以單一祖先序列的形式來自于植物[3]，陸生植物進(jìn)化過程中TLP基因含量和多樣性顯著增加[8]，而水稻和擬南芥TLP分布于多個支系，并存在染色體內(nèi)和染色體間的復(fù)制[3]。單子葉和雙子葉植物進(jìn)化上發(fā)生分離后，TLP基因在進(jìn)化枝上發(fā)生不對稱的增加[3]。Liu等[9]認(rèn)為TLP基因來自于大約10億年前的植物、動物和真菌的共同祖先。在有些植物中，同一染色體上甚至同一位點存在TLP基因簇，說明串聯(lián)重復(fù)是TLP超家族不對稱擴(kuò)張的重要機(jī)制[9]。研究表明，TLP具有抗真菌活性[10-11]、葡聚糖酶活性[12]、致敏原活性[13]等，在植物的生長發(fā)育和抵御脅迫過程中發(fā)揮作用。

密碼子具有簡并性，在物種的穩(wěn)定上起著重要的作用。同義密碼子在不同物種不同基因間的使用頻率不同，特定物種或基因家族在長期進(jìn)化中形成了適應(yīng)自身基因組環(huán)境的密碼子使用偏性。研究表明，同義密碼子的選擇使用對基因的表達(dá)起著重要的調(diào)節(jié)作用，有利于翻譯的準(zhǔn)確性和效率[14]。密碼子偏性分析有助于預(yù)測基因的表達(dá)水平[15]、基因功能分析[16]、選擇基因異源表達(dá)最適宿主和優(yōu)化密碼子以提高異源表達(dá)水平等[17]。

谷子(Setariaitalica)為禾本科糧食作物，富含蛋白質(zhì)、脂肪和維生素，廣泛栽培于歐亞大陸的溫帶和熱帶地區(qū)，其主產(chǎn)區(qū)多為干旱少雨地區(qū)[18]，中國主要集中在黃河中上游地區(qū)，是北方地區(qū)的主要糧食之一。栽培過程中，谷瘟病、干旱等生物和非生物脅迫是谷子高產(chǎn)的嚴(yán)重障礙，抗病和抗脅迫相關(guān)基因的研究將為谷子品種的選育提供借鑒。目前，谷子全基因組數(shù)據(jù)已公布[18]，這為基因功能和進(jìn)化研究提供了條件。本試驗從蛋白氨基酸和基因的堿基組成出發(fā)，對谷子TLP家族蛋白聚類關(guān)系、基因選擇性、編碼序列(Coding sequence，CDS)密碼子的組成及使用偏性進(jìn)行分析，旨在闡明TLP家族基因特征，為進(jìn)一步利用TLP家族基因培育優(yōu)良谷子品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 谷子TLP基因的鑒定與分析

以擬南芥TLP序列為探針，搜索谷子基因組數(shù)據(jù)庫(http:∥www.plantgdb.org/SiGDB/)和GenBank谷子蛋白數(shù)據(jù)庫，候選蛋白序列在SMART數(shù)據(jù)庫(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)中對蛋白功能域進(jìn)行確認(rèn)。所有蛋白序列生理生化特征通過Expasy(http:∥www.expasy.org/tools/)預(yù)測。

1.2 基因結(jié)構(gòu)分析

谷子TLP對應(yīng)的基因序列和CDS序列從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載。使用基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng)(http:∥gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)繪制基因結(jié)構(gòu)示意圖。

1.3 蛋白基因本體和聚類分析

利用基因本體(Gene ontology)數(shù)據(jù)庫(http:∥amigo1.geneontology.org/cgi-bin/amigo/blast.cgi)查詢TLP功能分類。利用WEGO在線軟件(http:∥wego.genomics.org.cn/)對蛋白Gene ontology(GO)富集度進(jìn)行計算。應(yīng)用MEGA 5.0軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。NJ進(jìn)化樹分析步長值為1 000，采用泊松校驗(Poisson correction)的方法計算距離，其余參數(shù)取默認(rèn)值。

1.4 啟動子特征分析

通過GenBank數(shù)據(jù)庫獲取谷子TLP基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游1 kb序列，通過PlantCARE(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因啟動子區(qū)順式作用元件分析。

1.5 密碼子偏性分析

使用軟件CodonW對谷子TLP基因CDS序列密碼子使用性參數(shù)進(jìn)行分析。參數(shù)包括：密碼子適應(yīng)指數(shù)(Codon adaptation index，CAI)、有效密碼子數(shù)(Effective number of codons，ENC)、密碼子的第3位的G+C含量(GC3s)。以GC3s為橫坐標(biāo)，ENC為縱坐標(biāo)，繪制ENC與GC3s的關(guān)聯(lián)分布圖[19]。圖中曲線為密碼子偏性僅受堿基突變影響時的ENC預(yù)期值的位置，計算公式為：ENC=2+GC3s+29/[GC3s2+(1-GC3s)2]。使用EMBOSS explorer網(wǎng)站(http:∥emboss.toulouse.inra.fr/)在線軟件對同義密碼子相對使用度(Relative synonymous codon usage，RSCU)進(jìn)行分析。根據(jù)ENC偏性對最優(yōu)密碼子(Optimal codon)進(jìn)行分析，選擇ENC值前后各10%作為低表達(dá)和高表達(dá)基因，分別計算2組基因中TLP基因密碼子的RSCU。當(dāng)△RSCU>0.3，且在高表達(dá)組中RSCU>1，在低表達(dá)組中RSCU<1，可確定該密碼子為最優(yōu)密碼子[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子TLP基因家族的鑒定

以擬南芥TLP序列為探針，從谷子基因組數(shù)據(jù)庫中共搜索并鑒定到43個TLP家族成員(表1)。通過SMART在線數(shù)據(jù)庫對谷子TLP進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，均含有典型索瑪甜(Thaumatin，THN)結(jié)構(gòu)域。谷子TLP基因在所有9條染色體上均有分布，其中Ⅸ和Ⅲ號染色體上基因成員較多(基因數(shù)均為9)，其次為Ⅱ、Ⅰ和Ⅴ號染色體(基因數(shù)分別為7、5和5)，Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ號染色體較少(基因數(shù)分別為2、3、1和2)。生理生化分析顯示，蛋白氨基酸數(shù)為160～666，其中氨基酸數(shù)較多的Si003953m和Si004228m均含有蛋白激酶功能域，可能在蛋白的磷酸化過程中發(fā)揮作用。蛋白等電點為4.42～9.17，其中酸性蛋白占76.7%。疏水性與蛋白結(jié)構(gòu)域形成和高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有重要關(guān)系，谷子TLP中疏水性蛋白占60.5%，具有較強(qiáng)親水和疏水活性的蛋白均為酸性蛋白。

表1 谷子中TLP家族信息Table 1 Information of TLP family in foxtail millet

2.2 基因和蛋白結(jié)構(gòu)及聚類分析

通過基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng)對谷子TLP基因結(jié)構(gòu)、內(nèi)含子組成與相位進(jìn)行分析(圖1)。43個谷子TLP基因分為3種結(jié)構(gòu)類型，其中含有1、2和3個外顯子的基因數(shù)目分別為16、12和15個。1-2型內(nèi)含子相位類型的基因數(shù)目最多(14個)，其次為1型和2型相位類型(均為5個)，同一聚類組中的多數(shù)基因外顯子數(shù)和內(nèi)含子相位類型一致(圖1)。

參考擬南芥和水稻等的研究[3,21]對谷子TLP家族進(jìn)行聚類分析。谷子TLP家族歸為12個聚類組，各聚類組中基因數(shù)不一致，聚類組5和6中基因數(shù)較多(分別為12和11)，其他聚類組中基因數(shù)相對較少(圖1)。聚類組5中的基因Si023305m、Si023379m、Si024779m、Si023433m均來自Ⅲ號染色體，基因Si037366m、Si039423m來自Ⅸ號染色體并且均只有1個外顯子，聚類組6中的基因Si017836m、Si017932m、Si017852m、Si019513m、Si020024m均位于Ⅰ號染色體，并且其位置臨近，內(nèi)含子相位均為1-2型。

TLP進(jìn)化組編號參考Shatters等[3]，Zhao等[21]Evolution group numbers according to the results of the evolutionary analysis Shatters,etal.[3]，Zhao,etal[21]

圖1谷子TLP家族進(jìn)化及基因結(jié)構(gòu)
Fig.1EvolutionandgenestructureofTLPfamilyinfoxtailmillet

2.3 蛋白GO功能分析

分析TLP的GO組成和功能分類，對了解其在植物生命進(jìn)程中的功能具有重要意義。在43條谷子TLPs中，發(fā)現(xiàn)12條不同的GO注釋子條目(圖2)。4類為細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分，其中參與細(xì)胞(cell，GO：0005623)和細(xì)胞組分(cell part，GO：0044464)結(jié)構(gòu)組成的均占58.1%，參與胞外區(qū)作用的(extracellular region，GO：0005576)占86.0%，參與共質(zhì)體構(gòu)成的(symplast，GO：0055044)占16.3%。3類在分子功能中起作用，具有結(jié)合功能(binding，GO：0005488)和催化活性(catalytic activity，GO：0003824)的蛋白均占4.7%，分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性(molecular transducer activity，GO：0060089)的蛋白占2.3%。5類參與了生物學(xué)過程，其中參與胞內(nèi)進(jìn)程(cellular process，GO：0009987)和代謝進(jìn)程(metabolic process，GO：0008152)的只占4.7%，參與多器官進(jìn)程(multi-organism process，GO：0051704)和響應(yīng)應(yīng)激(response to stimulus，GO：0050896)的均占88.4%，參與免疫系統(tǒng)進(jìn)程(immune system process，GO：0002376)的占20.9%。

圖2 谷子TLP蛋白GO功能分類Fig.2 GO classification of TLP in foxtail millet

2.4 啟動子特征

通過PLACE數(shù)據(jù)庫對谷子TLP基因上游1 kb啟動子區(qū)順式作用元件進(jìn)行分析(表2)，發(fā)現(xiàn)所有基因啟動子區(qū)均含有多個TATA-box和CAAT-box，部分基因含有Py-rich；所有基因啟動子區(qū)均含有1個到多個激素響應(yīng)元件，包括脫落酸響應(yīng)元件ABRE，茉莉酸響應(yīng)元件CGTCA-motif，赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif和P-box，水楊酸響應(yīng)元件TCA-element等；每個基因啟動子區(qū)均含有多個脅迫響應(yīng)元件，包括熱激響應(yīng)元件HSE，低溫反應(yīng)順式作用元件LTR，干旱響應(yīng)MYB結(jié)合位點MBS，防御和脅迫相關(guān)響應(yīng)元件TC-rich，受傷和真菌激發(fā)子響應(yīng)元件W-box?；蚝械募に鼗蛎{迫響應(yīng)元件數(shù)量和類型不同，可能是不同的基因在不同的信號通路中發(fā)揮作用，也說明該家族基因功能的多樣性和復(fù)雜性。

2.5 密碼子使用偏性

利用CodonW軟件和EMBOSS explorer數(shù)據(jù)庫對基因密碼子使用偏性進(jìn)行分析(表3)，發(fā)現(xiàn)谷子TLP基因的CAI值平均為0.282，60.5%的基因ENC值為28.12～35.00，ENC值反映基因編碼對密碼子選擇性強(qiáng)弱，一般ENC值低于35表示基因表達(dá)對密碼子的使用偏性較強(qiáng)。93.0%的基因GC3s為0.834～0.973，分布較集中，GC3s分布反映了植物所受的選擇壓力，GC3s分布范圍越小，表明密碼子使用偏性受自然選擇壓力影響越大[22]。以上結(jié)果表明，谷子TLP家族基因密碼子使用偏性較強(qiáng)，多數(shù)基因具有較高的表達(dá)潛力，基因在進(jìn)化過程中主要受到自然選擇壓力影響。

ENC與GC3s關(guān)聯(lián)分析顯示，谷子TLP基因分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方，多數(shù)ENC較小，ENC和GC3s分布相對集中(圖3)，說明不同的基因密碼子偏性較強(qiáng)，多數(shù)基因進(jìn)化過程中主要受到自然選擇壓力影響。

谷子TLP基因密碼子RSCU分析顯示(表4)，RSCU>1的密碼子均以G或C結(jié)尾，發(fā)現(xiàn)10個最優(yōu)密碼子，△RSCU>1的分別為編碼丙氨酸(Ala，GCG)、谷氨酸(Glu，GAG)、異亮氨酸(Leu，CTG)、脯胺酸(Pro，CCG)、精氨酸(Arg，CGC)、蘇氨酸(Thr，ACG)(表4)，表明谷子TLP家族基因偏好使用G或C結(jié)尾的密碼子。

表2 谷子TLP基因啟動子區(qū)順式作用元件信息Table 2 Information about putative cis-acting elements in the 1 kb upstream promoter region of TLP genes in foxtail millet

注：TATA-box轉(zhuǎn)錄起始區(qū)-30 bp核心啟動子元件； Py-rich高轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)順式作用元件；CAAT-box啟動增強(qiáng)元件；ABRE脫落酸響應(yīng)元件；CGTCA-motif茉莉酸響應(yīng)元件；GARE-motif赤霉素響應(yīng)元件；P-box赤霉素響應(yīng)元件；TCA-element水楊酸響應(yīng)元件；HSE熱激響應(yīng)元件；LTR參與低溫反應(yīng)的順式作用元件；MBS干旱響應(yīng)MYB結(jié)合位點；TC-rich防御和脅迫相關(guān)響應(yīng)元件；W-box受傷和真菌激發(fā)子響應(yīng)元件。

Note：TATA-box core promoter element around -30 of transcription start；Py-rich cis-acting element conferring high transcription levels；CAAT-box common cis-acting element in promoter and enhancer regions；ABRE cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness；CGTCA-motif cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness；GARE-motif gibberellin-responsive element；P-box gibberellin-responsive element；TCA-element cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness；HSE cis-acting element involved in heat stress responsiveness；LTR cis-acting element involved in low-temperature responsiveness；MBS MYB binding site involved in drought-inducibility；TC-rich cis-acting element involved in defense and stress responsiveness；W-box fungal elicitor responsive element.

表3 谷子TLP家族基因密碼子使用特性Table 3 Characterization of codon usage of TLP genes in foxtail millet

圖3 谷子TLP家族基因ENC與GC3s的關(guān)系Fig.3 Correlative analysis of ENC and GC3s of TLP genes in foxtail millet

3 討 論

谷子是目前種植第二廣泛的粟類作物，屬于典型的C4植物，比C3植物具有更高的水分利用效率和光合效率，特別能適應(yīng)干旱環(huán)境條件，是非生物脅迫抗性，特別是抗旱研究的模式植物[23]。Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，谷子在進(jìn)化過程中發(fā)生了3次染色體重組事件，其中2次發(fā)生在谷子從水稻分化之后，1次發(fā)生在谷子從高粱分化之后。這些事件導(dǎo)致部分基因家族大量擴(kuò)張，并為谷子具有強(qiáng)的抗旱能力奠定了基礎(chǔ)。TLP屬于多基因家族，不同物種基因組中TLP數(shù)量有很大差異，胡蘿卜(Daucuscarota)、黃瓜(Cucumissativus)等蔬菜中大約30個，水稻(Oryzasativa)、高粱(Sorghumbicolor)等作物中50～60個，火炬松(Pinustaeda)中大于80個[24]。研究表明，植物TLP家族蛋白在植物的生長發(fā)育和抵御脅迫過程中發(fā)揮作用[6-7]。

本研究通過生物信息學(xué)方法從谷子基因組中共發(fā)現(xiàn)43個TLP基因，多數(shù)為酸性蛋白。有3種基因結(jié)構(gòu)類型，其中僅有1個外顯子的基因有16個，1-2型內(nèi)含子相位的基因有14個，主要來自聚類組5和6中。這些基因多數(shù)位于同一染色體上，說明這些基因可能來源于同一祖先基因，是染色體內(nèi)和染色體間復(fù)制的結(jié)果。蛋白GO分類分析顯示86.0%的蛋白參與胞外作用，88.4%的蛋白參與多器官發(fā)育進(jìn)程和響應(yīng)應(yīng)激反應(yīng)，說明該家族蛋白在信號肽的引導(dǎo)下在胞外空間參與器官發(fā)育和應(yīng)對脅迫等進(jìn)程，在植物的生長發(fā)育和抵御環(huán)境脅迫過程中發(fā)揮重要作用。啟動子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，通過分析和預(yù)測啟動子區(qū)順式作用元件可以為基因表達(dá)和功能研究奠定基礎(chǔ)。谷子TLP家族啟動子區(qū)富含植物激素和病原響應(yīng)元件，表明這些基因參與植物多種生命進(jìn)程。

表4 谷子TLP基因同義密碼子使用情況Table 4 Usage of synonymous codon of TLP genes in foxtail millet

注：最優(yōu)密碼子標(biāo)注如下*.△RSCU>0.3；** △RSCU>0.6；*** △RSCU>1。

Note：Optimal codon marked as * △RSCU>0.3；** △RSCU>0.6；*** △RSCU>1.

在進(jìn)化過程中，植物基因組密碼子偏性主要受堿基突變和自然選擇壓力的影響，不同物種以及同一物種的不同基因受到的兩種壓力強(qiáng)度也不同。密碼子偏性與物種進(jìn)化和生存環(huán)境有關(guān)，密碼子偏性越強(qiáng)，基因在進(jìn)化過程中受到的選擇壓力越強(qiáng)。谷子TLP家族多數(shù)基因ENC低于35，GC3s分布集中，表明基因密碼子偏性強(qiáng)，基因具有較高的表達(dá)潛力，進(jìn)化過程中主要受自然選擇壓力影響。單子葉植物植物偏好G或C結(jié)尾的密碼子[25]?；騌SCU>1的密碼子均為G或C結(jié)尾，10個最優(yōu)密碼子，其中7個以G結(jié)尾，3個以C結(jié)尾，表明谷子偏好使用G或C結(jié)尾的密碼子，與玉米[25]、水稻和高粱[26]等密碼子使用偏性一致。物種受到正向選擇時會形成大量最優(yōu)密碼子[27]，進(jìn)一步說明谷子TLP基因在進(jìn)化過程中受到較強(qiáng)的正向選擇。進(jìn)行基因工程操作時，基因表達(dá)往往受到宿主密碼子偏性影響，通過修改外源基因密碼子，使之與宿主密碼子偏性一致，可實現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)[17,28]。本研究為谷子TLP基因的開發(fā)利用和轉(zhuǎn)基因研究提供了借鑒。

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