趙海斌，王媛媛，陶 虎

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

由專性寄生型真菌條形柄銹菌(Pucciniastriiformisf. sp.tritic,Pst)引起的小麥條銹病是一種氣傳病害，不僅是一種重要的世界性病害，也是長期影響中國小麥安全生產(chǎn)的嚴(yán)重生物災(zāi)害，一般流行年份可以造成約10%～30%產(chǎn)量損失，即年均約1億人的口糧損失，特大流行年份減產(chǎn)可達(dá)60%以上，甚至使小麥顆粒無收。作為活體營養(yǎng)型的銹菌在侵害寄主的過程中，形成與寄主細(xì)胞有著非常緊密聯(lián)系的唯一侵染結(jié)構(gòu)——吸器。病原銹菌可以通過吸器從寄主細(xì)胞獲取營養(yǎng)物質(zhì)[1]，同時(shí)通過吸器向寄主細(xì)胞分泌大量的效應(yīng)蛋白以抑制寄主的防御反應(yīng)，這對銹菌的成功入侵至關(guān)重要。Voegele研究小組克隆鑒定青豆銹菌吸器分泌蛋白R(shí)TP1，是首例被證明在植病親和互作中于吸器特異表達(dá)，然后轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)蛋白[2]。亞麻銹菌的AvrM和AvrL567效應(yīng)蛋白在病原菌侵染的過程中也從吸器被轉(zhuǎn)運(yùn)到寄主的細(xì)胞中，并且AvrM和AvrL567在不依賴病原菌轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的情況下也能夠進(jìn)入寄主細(xì)胞，它們的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于其N端的轉(zhuǎn)運(yùn)信號，說明它們的轉(zhuǎn)運(yùn)可能是利用寄主細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[3]。

雖然現(xiàn)有研究已經(jīng)表明吸器與寄主細(xì)胞之間存在大量分子轉(zhuǎn)運(yùn)，但目前對絕大多數(shù)效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和致病機(jī)理仍不清楚。雖然在AvrL567氨基酸序列上找不到任何同源的結(jié)構(gòu)域信息，但根據(jù)三維結(jié)構(gòu)的拓?fù)鋵W(xué)相似性在PDB數(shù)據(jù)庫中找到一個(gè)可能具有同樣功能的小麥褐斑病菌的毒素蛋白ToxA。而ToxA具有一個(gè)Arg-Gly-Asp結(jié)構(gòu)域，可以被寄主細(xì)胞膜上的類似整合素樣受體識(shí)別，經(jīng)過胞吞作用進(jìn)入寄主細(xì)胞，這個(gè)結(jié)果暗示AvrL567可能的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[4]。對AvrM的結(jié)構(gòu)研究揭示它能形成一個(gè)二聚體蛋白且具有一小塊保守的疏水表面，可以跟質(zhì)膜結(jié)合，對于該蛋白為什么在不依賴病原轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的時(shí)候也能進(jìn)入寄主細(xì)胞有了更深的認(rèn)識(shí)[5]。而這兩項(xiàng)研究充分說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)是開展效應(yīng)蛋白功能深入研究的重要手段，為揭示效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制奠定基礎(chǔ)，對解析銹菌的致病機(jī)理具有重要意義。

目前，可以使用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法來解析效應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)，通過比對已有的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)，找到相似的結(jié)構(gòu)域，來推理效應(yīng)蛋白的功能，之后通過生化方面的方法來驗(yàn)證[6]。本文初步對3個(gè)小麥條銹菌效應(yīng)蛋白進(jìn)行原核表達(dá)、純化以及溶解性研究，為核磁共振法或X-射線晶體衍射法解析其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[7]和研究小麥條銹菌侵染機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

表達(dá)載體pET-22b(+)、pET-32a-pp (+)、大腸桿菌菌株Turbo、BL21(DE3)都由西北農(nóng)林科技大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室保存并改造；效應(yīng)蛋白模板由西北農(nóng)林科技大學(xué)康振生教授饋贈(zèng)；Taq酶、PCR Mix、限制性內(nèi)切酶(NdeⅠ、NcoⅠ和XhoⅠ)、TA克隆試劑盒、T4DNA連接酶均購于寶生物工程 (大連) 有限公司；DNA Marker(DM2000)、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒均由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供；蛋白質(zhì)Marker購于Thermo Fisher Scientific公司；Ni-NTA agarose柱購自美國GE公司；HPLC 的型號FL2200購買于浙江福利分析儀器有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定[8]以康振生教授饋贈(zèng)的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因 pst-1178、 pst-1374和 pst-8713，并進(jìn)行TA克隆。使用NdeⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)，分別將 pst-1178、 pst-8713與載體pET-22b進(jìn)行重組，獲得重組表達(dá)載體pET-22b- pst-1178、pET-22b- pst-8713。使用NcoⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)，將 pst-1374與載體pET-32a-pp進(jìn)行重組，獲得重組表達(dá)載體pET-32a-pp- pst-1374。將測序正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)。

1.2.2 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)[9]挑取含有重組質(zhì)粒的BL21單克隆過夜擴(kuò)大培養(yǎng)，以體積比1∶500 轉(zhuǎn)接至1 L含100 mg Amp的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至OD600約0.6～0.8，待培養(yǎng)基冷卻至室溫后，加入終濃度1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。pET-22b- pst-8713、pET-32a-pp- pst-1374是20 ℃誘導(dǎo)12 h；pET-22b- pst-1178為37 ℃誘導(dǎo)5 h。6 000 r/min，4 ℃ 離心5 min收集菌體后用磷酸鹽緩沖液(PBS,20 mmol/L KH2PO4,0.15 mol/L NaCl,pH 7.9)重懸，加入150 μg/mL的溶菌酶，1∶104(核酸酶與裂解液的體積比)核酸酶，1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，混合均勻后冰浴30 min，每5 min混勻1次。超聲波破碎30 min (250 W，工作5 s，間歇5 s)后。12 000 r/min，4 ℃離心30 min。上清分離SDS-PAGE檢測，之后用0.22 μm的聚醚砜膜過濾后，備用。

1.2.3 蛋白質(zhì)的純化 目的蛋白pst-1178和pst-8713的純化：首先用含10 mmol/L咪唑的Tris緩沖液(20 mmol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH 7.9)平衡鎳柱(Ni-NTA)，將上述得到的上清液以1 mL/min勻速上樣；然后用洗滌溶液(20 mmol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH 7.9)沖洗3～5柱體積，最后用洗脫溶液(20 mmol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，0.250 mol/L 咪唑，pH 7.9)洗脫目的蛋白。之后測定洗脫的蛋白濃度，把配好的buffer A(φ=0.1% TFA)和buffer B(φ= 0.08% TFA，φ=70%乙腈)分別抽濾后，超聲除去氣泡。洗脫的目的蛋白先用0.22 μm濾膜過濾，在10 000 r/min離心2 min除去氣泡，用HPLC純化。經(jīng)Tricine-SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)純化效果，純化好的蛋白質(zhì)樣品，用真空冷凍機(jī)凍干，得到干粉，-80 ℃保存。

目的蛋白pst-1374的純化：鎳柱純化方法與蛋白pst-1178和pst-8713一致，然后用洗脫得到的目的蛋白中以體積比1∶100加入自備的Prescission Protease酶[10](1 mg/mL)酶切并用1 L透析液(20 mmol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，pH 7.9)透析12 h除去咪唑，降低鹽濃度。用buffer A (20 mmol/L Tris， pH 7.9)平衡HiTrap Q柱，將透析得到的蛋白液經(jīng)0.22 nm的聚醚砜膜過濾后用AKTA蛋白純化系統(tǒng)以0.8 mL/min流速上柱，上完樣品后繼續(xù)以buffer A沖洗10～15 min，直至基線走平。然后以buffer A、buffer B(20 mmol/L Tris，1mol/L NaCl，pH 7.9)進(jìn)行線性梯度洗脫，經(jīng)Tricine-SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)純化效果。給純化好的蛋白質(zhì)樣品中加入1 mmol/L 苯甲脒和φ=0.02%的NaN3,液氮速凍后-80 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

從長有含重組表達(dá)質(zhì)粒的3個(gè)Turbo平板上分別挑取單克隆搖菌并分別提取質(zhì)粒做PCR檢測(圖1、圖2、圖3)條帶大小與理論值一致。并送其質(zhì)粒至華大基因公司測序，結(jié)果與目的基因完全一致，表明表達(dá)載體pet-22b- pst-1178(圖1)、pet-32a-pp- pst-1374(圖2)和pet-22b- pst-8713(圖3)構(gòu)建成功。

M. TaKara DL2000 marker；1～4.4個(gè)單克隆 PCR products of recombinant plasmids from four different monoclonal cells；5. 陰性對照 Negative control

圖1陽性重組質(zhì)粒pET-22b-pst-1178的菌落PCR
Fig.1PCRproductsofpET-22b-pst-1178recombinantexpressionvectors

M.TaKara DL2000 marker；1. 陰性對照 Negative control； 2～3. 2個(gè)單克隆 PCR products of recombinant plasmids from two different monoclonal cells

圖2陽性重組質(zhì)粒pET-32a-PP-pst-1374的菌落PCR
Fig.2PCRproductsofpET-32a-PP-pst-1374recombinantexpressionvectors

2.2 目的蛋白表達(dá)與純化

2.2.1 pst-1178的表達(dá)純化 將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體破碎，離心后上清過鎳柱，將洗脫得到的融合蛋白經(jīng)HPLC純化，獲得比較純的目的蛋白(圖4)。純化后蛋白條帶與理論值(13 ku)不一致，大約是理論值的3倍。根據(jù)其他試驗(yàn)得出效應(yīng)蛋白pst-1178是以多聚體形式存在于鹽溶液中。

2.2.2 pst-1374的表達(dá)純化 將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體破碎，離心后上清過鎳柱，經(jīng)Elution buffer洗脫得到的融合蛋白約27 ku，用Prescission Protease酶酶切后得到約10 ku蛋白和17.2 ku標(biāo)簽蛋白。由于沒有酶切完全，所以圖中也有融合蛋白的條帶。經(jīng)HiTrap Q純化后得到單一條帶的電泳純目的蛋白且分子質(zhì)量與理論值一致(圖5、圖6)。

1～2.2個(gè)單克隆 PCR products of recombinant plasmids from two different monoclonal cells；3. 陰性對照 Negative control；M. TaKara DL2000 marker.

圖3陽性重組質(zhì)粒pET-22b-pst-8713的菌落PCR
Fig.3PCRproductsofpET-22b-pst-8713recombinantexpressionvectors

1～4.蛋白表達(dá)的部分 The parts of expression;1.未誘導(dǎo)的大腸桿菌 The cell lysate before induction；2.IPTG誘導(dǎo)后 The cell lysate after induction；3.超聲波碎后的上清 The supernatant；4.離心后的沉淀 The supernatant and pellet of cell lysate；M.蛋白分子量標(biāo)尺 Protein molecular weight marker (Thermo #26617)；5～8.鎳柱純化過程 The parts of nickel column purification；5.穿出 Flowthrough of supernatant of cell lysate during loading；6.10 mmol/L 咪唑的洗脫液 The wash of 10 mmol/L imidazole after loading；7、8.250 mmol/L 咪唑的洗脫液 Purification product eluted with 250 mmol/L imidazole lysis buffer；9.HPLC純化后的電泳純蛋白 Results of HPLC purification

圖4Tricine-SDS-PAGE分析pst-1178效應(yīng)蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及純化過程
Fig.4ExpressionandpurificationofHis-taggedpst-1178onTricine-SDS-PAGE

2.2.3 pst-8713的表達(dá)純化 將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體破碎，離心后上清過鎳柱，經(jīng)洗脫得到融合蛋白，再經(jīng)HPLC純化獲得比較純的目的蛋白，其分子質(zhì)量與理論值(11 ku)一致(圖7)。

1～4. 蛋白表達(dá)的部分 The parts of expression；1.未誘導(dǎo)的大腸桿菌 The cell lysate before induction；2.IPTG誘導(dǎo)后 The cell lysate after induction；3.超聲波碎后的上清 The supernatant；4.離心后的沉淀 The pellet of cell lysate；5～8.鎳柱純化過程 The parts of nickel column purification；5.穿出液 Flowthrough of supernatant of cell lysate during loading；6.10 mmol/L 咪唑的洗脫液 The wash of 10 mmol/L imidazole after loading；7、8.250 mmol/L 咪唑的洗脫液 Purification product eluted with 250 mmol/L imidazole lysis buffer；M.蛋白分子量標(biāo)尺 Protein molecular weight marker (Thermo #26611)

圖5Tricine-SDS-PAGE分析pst-1374效應(yīng)蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及純化過程
Fig.5ExpressionandpurificationofHis-tagpst-1374onTricine-SDS-PAGE

M.蛋白分子標(biāo)尺 Protein molecular weight marker (Thermo #26611)；1.Prescission protease酶 Prescission protease；2.酶切后的蛋白液 Effect of His-pst-1374 digested by prescission protease；3～5.第2次過鎳柱純化過程；3.穿出液 Loading flowt 10 mmol/L imidazole hrough of protease-digested product dialyzed in low imidazole buffer；4.10 mmol/L咪唑 10 mmol/L imidazole；5. 250 mmol/L 咪唑洗脫液 250 mmol/L imidazole lysis buffer； 6～7.陽離子交換柱的結(jié)果 Results of Q column；M. 蛋白分子量標(biāo)尺 Protein molecular weight marker (Thermo #26630)

圖6Tricine-SDS-PAGE分析pst-1374效應(yīng)蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及純化過程
Fig.6ExpressionandpurificationofHis-taggedpst-1374onTricine-SDS-PAGE

1～4. 蛋白表達(dá)的部分 The parts of expression；1.未誘導(dǎo)的大腸桿菌 The cell lysate before induction；2.IPTG誘導(dǎo)后 The cell lysate after induction；3.超聲波碎后的上清 The supernatant；4.離心后的沉淀 The pellet of cell lysate；5～8.鎳柱純化過程 The parts of nickel column purification；5.穿出液 Flowing through of supernatant of cell lysate during loading；6. 10 mmol/L的咪唑洗脫液 The wash of 10 mmol/L imidazole after loading；7、8. 250 mmol/L 咪唑洗脫液 Purification product eluted with 250 mmol/L imidazole lysis buffer；M1.蛋白分子量標(biāo)尺(Thermo #26611) Protein molecular weight marker (Thermo #26611);M2.蛋白分子量標(biāo)尺(Thermo #26617) Protein molecular weight marker (Thermo #26617)；9-10. HPLC純化后的電泳純蛋白 Present results of HPLC purification

圖7Tricine-SDS-PAGE分析pst-8713
Fig.7ExpressionandpurificationofHis-taggedpst-8713onTricine-SDS-PAGE

3 結(jié)論與討論

小麥條銹菌效應(yīng)蛋白，是一類吸器分泌性蛋白，與條銹菌侵染和致病性密切相關(guān)。本試驗(yàn)對于效應(yīng)蛋白的研究，為以后揭開條銹菌侵染途徑提供基礎(chǔ)。

本研究證實(shí)效應(yīng)蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中可溶性表達(dá)。用常規(guī)的純化方法來純化，可得電泳純的蛋白質(zhì)。純化后3個(gè)效應(yīng)蛋白的水溶性很好，濃縮后都未發(fā)生蛋白質(zhì)沉淀，為下一步通過核磁方法研究效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。

在 pst-1178的純化過程中，發(fā)現(xiàn)Tricine-SDS-PAGE電泳條帶分子質(zhì)量大小與理論值不符合，通過不同鹽濃度下 pst-1178的15N-HSQC二維譜證明這個(gè)蛋白可能是聚合物[11]，進(jìn)一步可采用動(dòng)態(tài)光散射等方法來測定其分子質(zhì)量并加以確證[10]。

今后，將通過解析效應(yīng)蛋白的三維結(jié)構(gòu)以及它們的體外、體內(nèi)的蛋白互作試驗(yàn)，深入探索效應(yīng)蛋白的調(diào)控通路，為尋找跨膜方式和闡明條銹菌侵染機(jī)制，及更有效長久地防治小麥條銹菌提供借鑒。

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