侯金星，雷穎楠，梁玉發(fā)，安小鵬，宋宇軒，曹斌云，李云甫，張 周

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動物工程分院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院,陜西楊凌 712100；3.新野縣動物疾病預(yù)防控制中心，河南新野 473500)

繁殖性狀是奶山羊的重要經(jīng)濟性狀。研究發(fā)現(xiàn)繁殖性狀不僅受神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和卵巢的細(xì)胞因子所調(diào)控，而且也受到microRNAs(miRNAs)的調(diào)控作用。miRNA的生物合成由RNA聚合酶Ⅱ啟動轉(zhuǎn)錄，由核內(nèi)核糖核酸酶Ⅲ Drosha和其輔酶DGCR8將初始模板(pri-miRNA)轉(zhuǎn)化為發(fā)夾樣復(fù)合物(pre-miRNA)。pre-miRNA隨后被出核蛋白5(Exportin 5)轉(zhuǎn)運入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，由第二種核糖核酸酶Ⅲ Dicer轉(zhuǎn)化為約22 nt的成熟miRNA[1-3]，廣泛存在于動植物基因組中，與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)[4-6]。它通常與靶基因mRNA完全或不完全匹配結(jié)合，誘導(dǎo)靶mRNA降解或阻遏其轉(zhuǎn)錄后翻譯，影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡，在動物繁殖過程中起至關(guān)重要的作用[7-9]。目前在牛和羊的卵巢中發(fā)現(xiàn)多個miRNA，例如miR-204、 miR-29a和miR-199等[10-12]。測序技術(shù)的發(fā)展極大地提高了miRNA的發(fā)現(xiàn)速度，多個物種的miRNA序列已被測定并公布[13-14]。迄今為止，miRNA數(shù)據(jù)庫(Release 21.0，http:∥www.mirbase.org/index.shtml)中牛的成熟miRNA有793個，山羊有436個，豬有411個，綿羊有153個。miRNA的表達(dá)具有發(fā)育階段性和組織特異性，通過序列特異性的堿基配對抑制mRNA的翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在卵巢發(fā)育顆粒細(xì)胞、排卵期功能調(diào)節(jié)、性腺激素合成以及黃體化過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，miR-93可以促進卵巢顆粒細(xì)胞的增殖[15]；miR-378通過調(diào)節(jié)卵丘細(xì)胞中的芳香酶基因表達(dá)，調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的成熟[16]。研究人員通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)51個miRNA能抑制顆粒細(xì)胞產(chǎn)生雌二醇[17]。miR-21、miR-132 和miR-212 通過調(diào)控促黃體素的分泌影響小鼠卵母細(xì)胞的成熟和排卵[18]。對體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞的研究表明，miR-378以性激素環(huán)化酶為靶點直接降低雌激素分泌[19]。這些研究表明miRNA在卵泡生長發(fā)育成熟等生理過程中起重要作用。

本研究在前期構(gòu)建的多羔(1胎3～5羔)和單羔(1胎1羔)關(guān)中奶山羊發(fā)情期卵巢差異表達(dá)miRNA文庫的基礎(chǔ)上，篩選在單羔奶山羊中顯著高表達(dá)的chi-miR-4110并推測其參與奶山羊的繁殖過程，利用生物信息學(xué)、qRT-PCR和Western blot等技術(shù)驗證chi-miR-4110的靶基因及其對靶基因的調(diào)控作用，揭示chi-miR-4110對奶山羊繁殖機能的調(diào)控作用，為提高奶山羊繁殖性能提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

卵巢組織樣采自楊陵上洛手村的奶山羊屠宰廠。采集時，將新鮮卵巢浸泡在滅菌后的PBS溶液中，放入冰盒，立即帶回細(xì)胞間處理，卵巢顆粒細(xì)胞的分離參照Peng 等[20]的方法。

1.2 試劑及儀器

Opti-MEMⅠ、胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基購自 Gibco 公司，DMSO(二甲基亞砜)、TRIzol試劑、Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 Fermentas 公司，RT-qPCR試劑盒購自日本 TaKaRa 公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國 ABI 公司，BCA 蛋白定量試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，PCR 擴增儀購自美國 ABI 公司，實時定量儀器購自美國 Bio-rad 公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和RNAs提取

奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞和人腎上皮細(xì)胞 293T 使用含φ=10% 胎牛血清的 DMEM-F12 培養(yǎng)基在37 ℃、φ=0.5% CO2的條件下培養(yǎng)[21]。用TRIzol法提取奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞總 RNA。用核酸定量儀檢測 RNA 的質(zhì)量和質(zhì)量濃度。

1.4 Smad2基因3′UTR片段的克隆

利用Targetscan、miRBase、RNAhybrid 2.1數(shù)據(jù)庫預(yù)測chi-miR-4110的靶基因是 Smad2。根據(jù)GenBank中山羊 Smad2基因3′UTR序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計上、下游引物(表1)，在上、下游引物的5′端加上XhoⅠ和NotⅠ內(nèi)切酶的酶切位點，并在酶切位點前加2～3個保護堿基。引物由上海生物技術(shù)工程公司合成。根據(jù)引物的退火溫度設(shè)置范圍(56 ℃～63 ℃)，進行梯度PCR試驗，篩選最適退火溫度進行PCR擴增，并純化回收PCR凝膠產(chǎn)物，將純化回收的目的片段連接到pMD19-T連接載體上，將重組載體轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞(大腸桿菌DH5α)中涂板培養(yǎng)，將陽性單克隆擴大培養(yǎng)后，吸取1 mL送至上海生物技術(shù)工程有限公司測序，測序結(jié)果用Blast對比分析，篩選含有目的基因的陽性載體。

表1 Smad2-3′UTR的引物序列Table 1 Primer sequence of Smad2-3′UTR

注：下劃線的堿基為酶切位點，斜體的堿基為保護堿基。

Note：Underlined bases are cleavage site,and protective bases are italic.

1.5 雙熒光素酶活性檢測

將PCR擴增的 Smad2基因 3′UTR片段和psiCHECK-2載體分別進行雙酶切(XhoⅠ和NotⅠ)，然后將純化回收得到的 Smad2-3′UTR片段和載體psiCHECK-2用T4連接酶連接，將重組載體轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)中涂板培養(yǎng)，將陽性單克隆擴大培養(yǎng)后，吸取1 mL送至上海生物技術(shù)工程有限公司測序，測序結(jié)果用Blast對比分析，篩選含有目的基因的陽性載體。

取對數(shù)生長期 293T細(xì)胞接種于24孔板，將chi-miR-4110 mimics(序列UAGCAGCACAGAAAUGUUGGUA)或陰性對照(Negative control,NC)與構(gòu)建的psiCHECK2- Smad2-3′UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染分為3組，試驗組1： Smad2-3′UTR+chi-miR-4110 mimics (SRM)；對照組1： Smad2-3′UTR (SR)；對照組2： Smad2-3′UTR+ NC(SNC)。轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行。轉(zhuǎn)染36 h 后，用裂解緩沖液PLB裂解細(xì)胞并檢測其熒光強度。使用多功能酶標(biāo)儀測定熒光素酶的活性，每次檢測試驗分別進行獨立的3次重復(fù)，用螢火蟲熒光素酶活性校正海參熒光素酶活性。

1.6 Smad2基因mRNA表達(dá)量的檢測

根據(jù) GenBank中山羊 Smad2 基因的mRNA序列，用Primer 5.0設(shè)計實時定量PCR引物(RT-qPCR)，引物信息見表2。以GAPDH為內(nèi)參基因，用SYBR Primer ExTaqII (TaKaRa) 試劑盒檢測mRNA的相對表達(dá)量。每個樣品3個重復(fù)，反應(yīng)體系為20 μL：12.5 μL Platinum RTS SYBR Super Mix，1 μL Forward Primer，1 μL Reverse Primer，1 μL cDNA模板，4.5 μL DNAase-free dH2O。用2-ΔΔCt法分析 Smad2 基因的mRNA相對表達(dá)量。

表2 RT-qPCR引物信息Table 2 Primer sequence of RT-qPCR

1.7 Western blot檢測

將Lipofectamine 2000分別與chi-miR-4110 mimics、NC和chi-miR-4110抑制劑(nhibitor)及抑制劑陽性對照物(inhibitor NC)混勻后，轉(zhuǎn)染奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞，轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞提取蛋白。用SDS-PAGE凝膠電泳對提取的蛋白進行Western blot檢測。用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶，用ImageJ2X對其成像結(jié)果進行灰度分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 chi-miR-4110靶基因的預(yù)測

利用生物信息學(xué)分析chi-miR-4110的靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)chi-miR-4110與 Smad2 mRNA 1 706～1 727 bp位點結(jié)合，初步確定 Smad2為chi-miR-4110的靶基因(圖1)。

圖1 chi-miR-4110與 Smad2 mRNA 1 706～1 727 bp位點結(jié)合Fig.1 chi-miR-4110 binds at 1 706-1 727 bp positions of Smad2 mRNA

2.2 Smad2-3′UTR的克隆和酶切鑒定

用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示，目的條帶單一、清晰，且長度與目的片段一致，初步判定該PCR產(chǎn)物為目的片段，將測序結(jié)果進行Blast對比，結(jié)果顯示，該片段為 Smad2基因的3′UTR。將psiCHECK-2空載體和含有目的片段的重組載體同時進行酶切，分別可以得到大小不同的2個片段，其中重組載體的小片段為207 bp，與目的片段的大小相同(圖3)。

1～4.PCR產(chǎn)物 PCR products;M.DNA marker Ⅰ

圖2Smad2-3′UTR的PCR產(chǎn)物
Fig.2PCRproductsofSmad2-3′UTR

1.Check2 載體 Check2 vector; 2.重組載體 Recombination vector;M.DNA marker Ⅲ

圖3酶切凝膠電泳圖
Fig.3Electrophoresismapofenzymedigestionanalysis

2.3 雙熒光素酶的活性

為驗證chi-miR-4110是否能與 Smad2的3′UTR 區(qū)直接結(jié)合，試驗組、對照組1和對照組2分別被轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，36 h后收集并裂解細(xì)胞，檢測其熒光素酶活性。結(jié)果顯示，與對照組1和2相比，試驗組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05，圖4)。表明chi-miR-4110可與 Smad2-3′UTR作用位點相結(jié)合抑制其表達(dá)，從而導(dǎo)致熒光素酶的活性降低，由此可知， Smad2是chi-miR-4110的靶基因。

SNC. Smad2-3′UTR載體+陰性對照模擬物 Smad2-3′UTR vector + NC; SR. Smad2-3′UTR 載體 Smad2-3′UTR vector;SRM. Smad2-3′UTR+ chi-miR-4110模擬物 Smad2-3′UTR+chi-miR-4110 mimics; *.表示差異顯著(P<0.05)，下同 * representsP<0.05，the same below

圖4熒光素酶的相對活性
Fig.4Relativeactivityofluciferase

2.4 Smad2基因 mRNA及蛋白的表達(dá)量

將chi-miR-4410模擬物、NC和inhibitor、inhibitor NC轉(zhuǎn)染到卵巢顆粒細(xì)胞中后，提取RNA及蛋白。以GAPDH為內(nèi)參，通過實時定量PCR檢測 Smad2 mRNA在奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞中的相對表達(dá)量。qRT-PCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染chi-miR-4110后 Smad2 mRNA的表達(dá)量顯著低于NC組(P<0.05，圖5)；轉(zhuǎn)染inhibitor 后mRNA表達(dá)水平上調(diào)，由此說明過表達(dá)chi-miR-4110使 Smad2 mRNA表達(dá)量降低。 Western blot檢測Smad2蛋白的表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參做差異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染chi-miR-4110后Smad2蛋白的表達(dá)量顯著低于NC組(P<0.01，圖6)；轉(zhuǎn)染inhibitor后蛋白水平顯著高于Inhibitor NC組 (P<0.05)，表明chi-miR-4110對Smad2蛋白的表達(dá)量起負(fù)調(diào)控作用。

3 討 論

**表示差異極顯著(P<0.01)，下同 ** representsP<0.01，the same as below.

圖5Smad2mRNA的相對表達(dá)量
Fig.5RelativeexpressionofSmad2mRNA

A.蛋白免疫印跡雜交檢測Smad2蛋白表達(dá) Smad2 protein were detected by western blot; B.Smad2蛋白相對表達(dá)量 Relative expression of Smad2 protein

圖6chi-miR-4110抑制Smad2蛋白表達(dá)
Fig.6chi-miR-4110inhibitsexpressionofSmad2protein

卵泡在生長過程中受到多種細(xì)胞內(nèi)分泌或旁分泌因子的調(diào)節(jié)，其中大部分屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族。Smads家族成員是TGF-β超家族的細(xì)胞內(nèi)信號介質(zhì)，在顆粒細(xì)胞中階段特異性表達(dá)，能夠調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖、凋亡以及分化，同時對正常卵母細(xì)胞的生長發(fā)育、排卵和黃體化起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[22]。Smad2在 Smads 家族中屬于受體調(diào)節(jié)型蛋白，通常情況下， Smad2的表達(dá)與TGF-β密切相關(guān)，Smads直接被 TGF-β I型受體(TGF-βRI)磷酸化[23]。Smad2蛋白隨著綿羊卵泡的發(fā)育，在卵泡的顆粒細(xì)胞持續(xù)表達(dá)，且腔前卵泡顆粒細(xì)胞中Smad2的表達(dá)量顯著低于有腔卵泡的顆粒細(xì)胞[24]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除雌鼠的 Smad2和 Smad3基因，小鼠會出現(xiàn)卵泡發(fā)育和排卵異常，生殖力顯著下降[25]。徐夢思等[26]研究表明， Smad2基因在梅山豬M2卵泡(5.0～6.9 mm)中的表達(dá)量極顯著高于杜洛克， Smad3和 Smad4在梅山豬 M1卵泡(1.0～3.0 mm)、 M2卵泡和L卵泡(7.0 mm)中的表達(dá)量分別顯著和極顯著高于杜洛克，揭示 TGF-β/Smad信號通路基因在卵泡發(fā)育及成熟的過程中發(fā)揮重要作用。 Smad4是不同 TGF-β信號通路配體信息傳遞的必需中心分子， 抑制 Smad4可促進豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡[27]， 敲除 Smad4 基因后小鼠在胚胎期就會出現(xiàn)死亡[28]。Yao等[29]研究發(fā)現(xiàn) Smad4 是miR-224的靶基因，miR-224的過表達(dá)能夠顯著降低小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中Smad4的蛋白水平，但對 Smad4 基因mRNA水平無顯著影響，表明miR-224是通過抑制 Smad4翻譯過程調(diào)控該基因的表達(dá)，此外，還揭示miR-224/Smad4 可以介導(dǎo)TGF-β調(diào)控小鼠雌二醇分泌以及腔前顆粒細(xì)胞的增殖。本研究的熒光素酶檢測結(jié)果表明，chi-miR-4110通過與 Smad2-3′UTR相互作用導(dǎo)致熒光素酶活性降低，初步鑒定 Smad2為chi-miR-4110的靶基因。將chi-miR-4110 mimics和陰性對照分別轉(zhuǎn)染到奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞中，qRT-PCR和Western blotting結(jié)果表明，在奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞中，過表達(dá)chi-miR-4110導(dǎo)致 Smad2 基因的mRNA以及Smad2蛋白的表達(dá)量均顯著降低，表明chi-miR-4110通過降解 Smad2基因的mRNA和抑制其蛋白的翻譯調(diào)控該基因的表達(dá)。

4 結(jié) 論

Smad2是chi-miR-4110的靶基因，在奶山羊卵巢顆粒細(xì)胞中chi-miR-4110靶向調(diào)控 Smad2的表達(dá)。揭示chi-miR-4110通過TGF-β/Smad信號通路調(diào)控卵泡的生長發(fā)育和排卵。

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