張金鈴，田 毅，榮培晶*，方繼良，王 瑜，石 力，賈術(shù)永，何 勛， 雷洪濤，孟 宏

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所，北京 100700； 2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院，北京 100037； 3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京 100053； 4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700； 5.北京工商大學(xué)理學(xué)院化妝品系，北京 100048)

“內(nèi)關(guān)”是臨床上首選常用于治療心絞痛、心肌炎、心律不齊等心臟疾病的穴位，大量臨床和小型動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)了針刺“內(nèi)關(guān)”療效的作用機(jī)理[1]，但針灸“內(nèi)關(guān)”應(yīng)用于治療大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌缺血的研究未見(jiàn)報(bào)道。大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物豬的心臟冠狀動(dòng)脈解剖結(jié)構(gòu)及血流動(dòng)力學(xué)生理病理特點(diǎn)與人類(lèi)相近，其慢性心肌缺血模型更符合缺血性心肌病的臨床病理生理過(guò)程[2]，故本研究擬采用心血管系統(tǒng)與人類(lèi)更為接近的巴馬小型豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[3]。通過(guò)手術(shù)放置Ameroid縮窄環(huán)于左前降支建立小型豬慢性心肌缺血模型，并采用埋針進(jìn)行治療[4]，探討該系列方法的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用普通級(jí)巴馬小型豬12只，雌雄不限，體重18～30 kg，7～8月齡。巴馬小型豬造模后隨機(jī)分為治療組針刺內(nèi)關(guān)穴(PC6)和對(duì)照組針刺足三里穴(ST36)，每組6只。動(dòng)物由北京通和生態(tài)比較醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供 [SCXK (京) 2015-004]，自由飲水，分籠飼養(yǎng)，每天視動(dòng)物攝食情況補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)豬飼料，術(shù)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，術(shù)后飼養(yǎng)7周 [SYXK (京) 2014-0014]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合倫理要求，實(shí)驗(yàn)程序通過(guò)了中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：2013-1-25-973)。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉鹽：Genview分裝，批次號(hào)：37H10520；華佗牌針灸針：直徑0.25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品；G3H型多參數(shù)動(dòng)物監(jiān)護(hù)儀：深圳市杰納瑞醫(yī)療儀器有限公司；AM811型麻醉機(jī)：北京易世恒電子技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小型豬心肌慢性缺血模型制備[5-7]改良方法

小豬術(shù)前24 h禁食水，采用戊巴比妥鈉進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，選取耳緣靜脈建立液體通道，吸入異氟烷維持麻醉。小型豬麻醉后，插入氣管內(nèi)導(dǎo)管，呼吸機(jī)輔助呼吸，連接心電監(jiān)護(hù)儀備用。手術(shù)區(qū)備皮并常規(guī)消毒鋪巾。于左側(cè)第3肋間前外側(cè)作長(zhǎng)約8 cm的橫切口入胸并注意止血。在左冠狀動(dòng)脈左前降支第一對(duì)角支分叉處以下約1 cm處放置Ameroid縮窄環(huán)。于左心耳水平處剪開(kāi)心包并懸吊，于左心耳肺動(dòng)脈之間尋找左前降支(left anterior descending branch，LAD)主干，小心分離動(dòng)脈表面的心外膜及脂肪組織，尤其應(yīng)注意不要損傷小的深穿支以防出血。游離長(zhǎng)度約為1.5 cm，小心地將直角鑷挑起游離出的LAD主干兩端，同時(shí)，用血管鉗夾持Ameroid環(huán)，使側(cè)口對(duì)準(zhǔn)冠狀動(dòng)脈，將LAD迅速套入環(huán)中?？s窄環(huán)植入完畢后，調(diào)整環(huán)的位置，使其位于左心耳與肺動(dòng)脈之間的溝內(nèi)，同時(shí)缺口朝向心包方向，以防縫合心包后壓迫損傷心肌或使縮窄環(huán)脫出。觀察有無(wú)出血及縮窄環(huán)位置有無(wú)阻礙血流。確認(rèn)無(wú)誤后關(guān)閉心包，膨肺后關(guān)胸。待自主呼吸恢復(fù)后，拔除氣管插管，送回動(dòng)物房。術(shù)后連續(xù)肌注青霉素3 d預(yù)防感染，定期觀察切口情況及動(dòng)物的一般狀態(tài)。

1.3.2 干預(yù)方法

心臟慢性缺血造模后4周進(jìn)行內(nèi)關(guān)和足三里埋針并電針。埋針前提前取出7號(hào)埋線針的內(nèi)芯，截取1.5 cm并用砂紙將兩端打磨光滑，將處理好的內(nèi)芯浸泡在75%的酒精中消毒待用。埋針時(shí)用鑷子夾取一段處理好的內(nèi)芯，從9號(hào)針突孔置在穿刺針套管的前端，從套管尾孔插入一根內(nèi)芯。右手持針柄，左手夾住套管中下段，將7號(hào)針芯快速刺入皮下肌層，退出9號(hào)針。消毒后紗布包好針孔，防止出血。電針于檢測(cè)前預(yù)處理，將小型豬麻醉后置于操作臺(tái)面監(jiān)控下行針，毫針勻速進(jìn)針足三里或內(nèi)關(guān)，接通韓式電針儀。

注：A：術(shù)后心臟；B：足三里組；C：內(nèi)關(guān)組。箭頭指示缺血區(qū)域。圖1 術(shù)后心臟大體病理觀察及缺血模型術(shù)后各組的心臟切片形態(tài)改變(TTC染色)Note. A: Heart after operation. B: “Zusanli” (ST36) group.C: “Neiguan” (PC6) group. Arrows indicate the ischemic area.Fig.1 Gross appearance of heart and morphological changes of cardiac sections in each group after modeling of chronic myocardial ischemia. TTC staining

1.3.3 觀察及指標(biāo)檢測(cè)

(1)肉眼大體觀察：取出心臟后大體病理觀察有無(wú)缺血的室壁瘤形成，針刺足三里和內(nèi)關(guān)組心臟形態(tài)顏色區(qū)別觀察，拍照。

(2)TTC大體病理染色觀察：方法改良后為預(yù)先配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的TTC磷酸鹽緩沖液于染色缸中，放入恒溫水浴箱恒溫約30 min使達(dá)到37℃。取出心臟后快速以垂直心臟長(zhǎng)軸的角度，染色切片從左心尖開(kāi)始，切片到縮窄環(huán)部位，每片厚度1 cm，共計(jì)切7片，放入染色缸中染色20 min后依次取出拍照，第一片染色拍照一張，第二至七片各染色拍照兩面兩張，故每只心臟共計(jì)染色拍照13張，觀察各切片心肌顏色。

(3)超微結(jié)構(gòu)觀察：取材心臟后隨機(jī)選取內(nèi)關(guān)組和足三里組各3例進(jìn)行超微電鏡取材，每只心臟取缺血區(qū)和非缺血區(qū)各取一塊組織。電鏡方法參照文獻(xiàn)[8]，取材心肌組織黃豆大小，即刻順肌纖維方向切成約1 mm組織塊，4%戊二醛和1%四氧化鋨雙重固定，脫水、包埋、超薄切片70 nm，采用日立H7650透射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 小型豬心臟肉眼觀察大體病理改變

摘除心臟后大體觀察結(jié)果如圖1A所示，慢性心肌缺血手術(shù)后，心臟左室靠近室間隔部位可看到明顯的圓形皺褶微紅區(qū)，心臟右側(cè)和右心室前側(cè)暗紅色，可觸摸到心室壁薄變。

2.2 針刺后慢性心肌缺血小型豬心臟TTC病理染色結(jié)果

針刺內(nèi)關(guān)穴后，染色切片前10張基本是暗紅色，還沒(méi)有出現(xiàn)明顯的缺血紅色區(qū)。針刺內(nèi)關(guān)穴后的第11～12張染色片出現(xiàn)淡紅色缺血環(huán)區(qū)。針刺后足三里組從第3張染色片以后的各個(gè)切片均可見(jiàn)淡紅色化的缺血區(qū)。選取足三里組和內(nèi)關(guān)組典型圖發(fā)現(xiàn)，第11張染色片(1B和1C)顯示缺血出現(xiàn)的鮮紅色中有些許發(fā)白區(qū)域，提示本實(shí)驗(yàn)條件下手術(shù)后出現(xiàn)了缺血區(qū)域，心肌慢性缺血模型成功；循心包經(jīng)針刺內(nèi)關(guān)穴可以減少缺血心肌數(shù)量，對(duì)缺血心肌的保護(hù)效應(yīng)強(qiáng)于足三里穴的效應(yīng)。

2.3 電鏡透射掃描心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變結(jié)果

如圖2A所示，正常豬心肌細(xì)胞電鏡圖可見(jiàn)線粒體嵴排列整齊、密集，線粒體膜完整，空泡化線粒體少見(jiàn)，肌絲排列整齊致密。針刺足三里心肌細(xì)胞(如圖2B所示)線粒體出現(xiàn)空泡化，嵴消失，有些線粒體缺失，結(jié)構(gòu)不清，心肌纖維化明顯。針刺內(nèi)關(guān)組缺血區(qū)心肌細(xì)胞電鏡圖(圖2C)顯示，散在的線粒體內(nèi)部嵴消失，部分線粒體缺如，肌絲結(jié)構(gòu)不清，纖維化明顯，和足三里組比較無(wú)明顯差異。

注：A：正常心??；B：足三里組缺血區(qū)心?。籆：內(nèi)關(guān)組缺血區(qū)心肌。圖2 缺血造模術(shù)后各組心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)比較(× 30 000)Note. A: Normal myocardium. B: “Zusanli’ (ST36) group. C: “Neiguan” (PC6) group.Fig.2 Comparison of ultrastructure of the cardiomyocytes in each group after operation for modeling of chronic myocardial ischemia

3 討論

缺血性心肌病是目前人類(lèi)死亡率越來(lái)越高的疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)缺血性心臟病、中風(fēng)和慢性阻塞性肺疾病占全球約32%的死亡原因，而缺血性心臟病位居第一[9-10]。研究表明，電針心包經(jīng)“內(nèi)關(guān)”-“間使”可通過(guò)改善交感、迷走活動(dòng)的平衡實(shí)現(xiàn)降低血清心肌酶及內(nèi)皮素的水平來(lái)減輕缺血性心肌損傷[11]，但都是采用小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠、小鼠，本研究的慢性心肌缺血模型是冠狀動(dòng)脈漸進(jìn)性阻塞逐漸發(fā)展到心肌缺血狀態(tài)而引起病變，這種大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的慢性模型更符合臨床疾病生理病理過(guò)程。實(shí)驗(yàn)豬的心臟冠狀動(dòng)脈解剖結(jié)構(gòu)及側(cè)枝循環(huán)與人類(lèi)相似，心肌有相對(duì)較多的冠狀動(dòng)脈側(cè)枝循環(huán)，造模后存活率高，豬的慢性心肌缺血模型可為研究針刺預(yù)防和治療心肌缺血、冠狀動(dòng)脈側(cè)枝循環(huán)生成等提供條件[12-16]。本研究埋針并電針的療法應(yīng)用于與人類(lèi)更為相近的大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌缺血模型豬的設(shè)計(jì)尚屬首創(chuàng)。

大體病理在臨床上通常是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，本研究心臟的大體病理染色采用氯化三苯基四氮唑(TTC)，是一種脂溶性光敏感復(fù)合物，常用作染色劑檢測(cè)哺乳動(dòng)物組織的缺血梗塞，正常組織表現(xiàn)為暗紅色，它與組織中脫氫酶反應(yīng)后，缺血組織表現(xiàn)鮮紅色或淡紅色，但梗死組織中脫氫酶活性下降不能與其反應(yīng)，故不被染色呈蒼白色[17]。本研究針刺“內(nèi)關(guān)”后TTC病理染色結(jié)果顯示，第11張染色片始有缺血紅色區(qū)可見(jiàn)。針刺“足三里”穴第3張染色片就隱約可見(jiàn)淡紅色的缺血區(qū)。手術(shù)后均出現(xiàn)TTC染色病理切片鮮紅色缺血區(qū)，說(shuō)明此種手術(shù)放置縮窄環(huán)造模慢性心肌缺血方法成功，同時(shí)比較此兩例顯示治療組針刺“內(nèi)關(guān)”穴對(duì)缺血的抑制效應(yīng)強(qiáng)于對(duì)照組針刺“足三里”穴。

線粒體具有為細(xì)胞提供能量、參與細(xì)胞分化、細(xì)胞信息傳遞等一系列細(xì)胞代謝離子通道的功能，它的損傷是很多疾病產(chǎn)生的根源，故線粒體的保護(hù)機(jī)制的研究顯現(xiàn)出越發(fā)重要的作用。線粒體腫脹、形態(tài)改變是線粒體損傷的重要特征[18]，透射電鏡可以直觀地觀察到線粒體嵴斷裂消失減少、線粒體腫脹等損傷狀況。本實(shí)驗(yàn)透射電鏡觀察線粒體損傷程度發(fā)現(xiàn)慢性心肌缺血造模手術(shù)后針刺“足三里”和“內(nèi)關(guān)”穴心肌細(xì)胞均出現(xiàn)線粒體空泡化，嵴消失，有些線粒體缺失，看不到肌絲，結(jié)構(gòu)不清，纖維化明顯。說(shuō)明手術(shù)后導(dǎo)致了心肌細(xì)胞線粒體的損傷模型成功，針刺心包經(jīng)穴位“內(nèi)關(guān)”沒(méi)有表現(xiàn)出比“足三里”更好的抑制線粒體超微結(jié)構(gòu)變異的效應(yīng)。

本研究結(jié)果可見(jiàn)針刺“內(nèi)關(guān)”可以減少慢性心肌缺血的面積，提示針刺心包經(jīng)“內(nèi)關(guān)”穴可以通過(guò)減少心肌細(xì)胞缺血損傷數(shù)量的途徑來(lái)起到保護(hù)心肌的效應(yīng)，而不能抑制已經(jīng)造成缺血損傷細(xì)胞的線粒體變異的程度。

小型豬的生理特性與人類(lèi)最為接近，且對(duì)缺血性損傷敏感。以往慢性缺血模型多采用冠脈結(jié)扎、藥物、球囊等方式，病程較急，死亡率高。故本實(shí)驗(yàn)探索采用巴馬小型豬冠狀動(dòng)脈前降支放置縮窄環(huán)的方法，雖然需要操作人員的精湛技術(shù)，但成模率能達(dá)到大約80%，缺血梗死面積基本可控，模型動(dòng)物存活時(shí)間長(zhǎng)，利于實(shí)施慢性針灸效應(yīng)和不同方式強(qiáng)度電針效應(yīng)觀察，重要的是這種可用于針灸療效研究的模型與人類(lèi)慢性心肌缺血疾病的發(fā)生發(fā)展的病理生理過(guò)程相似度高。

本研究說(shuō)明手術(shù)放置Ameroid縮窄環(huán)于左前降支建立小型豬慢性心肌缺血模型，并采用埋針進(jìn)行治療的系列創(chuàng)新方法是可行的，實(shí)現(xiàn)了將傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的精華埋針并電針治療方法應(yīng)用于大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究的跨越。

[1] 王雙昆, 盧晨, 王友京. 不同頻率電針“內(nèi)關(guān)”穴對(duì)心肌缺血再灌注大鼠血管活性物質(zhì)的影響 [J]. 針刺研究, 2015, 40(5): 378-382.

[2] 盧志強(qiáng), 張艷軍, 崔廣智, 等. 心肌缺血模型的制作方法研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2012, 28(8): 1053-1057.

[3] Suzuki Y, Yeung AC, Ikeno F. The representative porcine model for human cardiovascular disease [J]. J Biomed Biotechnol, 2011, 2011:195483.

[4] 張今朝, 朱秀玲, 趙青, 等. 內(nèi)關(guān)穴埋針治療小型豬慢性心肌缺血的心臟CT注射優(yōu)化方法 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2016, 31(10): 4288-4290.

[5] 科雨彤, 田叢娜, 魏紅星, 等. 門(mén)控心肌灌注和心肌代謝顯像動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)小型豬室壁瘤形成后左心室功能和重構(gòu)變化的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2015, 30(6): 580-584.

[6] 科雨彤, 田毅, 田叢娜, 等. 門(mén)控心肌灌注和心肌代謝顯像評(píng)價(jià)新方法制作小型豬室壁瘤模型的可行性 [J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志, 2015, 44(5): 28-32.

[7] 張波, 陳保富, 馬德華, 等. 經(jīng)胸腔鏡建立巴馬小型豬慢性心肌缺血模型 [J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志, 2014, 43(7): 104-107.

[8] 張維清, 吳秀英. 環(huán)磷腺苷葡甲胺對(duì)新生缺氧缺血性腦病豬心肌CREB含量的影響 [J]. 解剖科學(xué)進(jìn)展, 2016, 22(1): 23-25.

[9] 王潔, 胡玲, 許靜, 等. 電針不同穴組對(duì)心肌缺血大鼠海馬腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、酪氨酸激酶B表達(dá)的影響 [J]. 針刺研究, 2016, 41(1): 40-44.

[10] GBD 2013 Mortality and Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex specific all-cause and cause-specific mortality for 240 causes of death, 1990-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013 [J]. Lancet, 2015, 385(9963): 117-171.

[11] 陳偉, 陳淑萍, 李成文, 等. 大鼠疑核-迷走神經(jīng)介導(dǎo)針刺“內(nèi)關(guān)”-“間使”改善心肌缺血機(jī)制的研究 [J]. 針刺研究, 2016, 41(3): 189-196.

[12] 于震, 劉建勛. 慢性心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭苽浞椒?[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2005, 21(3): 273-276.

[13] 潘永明, 陳亮, 徐孝平, 等. 痰瘀互結(jié)證慢性心肌缺血小型豬模型的建立 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 25(9): 1-7.

[14] 譚偉江, 王靜, 李想, 等. 蕨麻小型豬心梗模型的建立及梗死邊緣區(qū)基因表達(dá)譜分析 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2016, 24(6): 558-566.

[15] 龐琳琳, 張會(huì)永, 楊關(guān)林. 巴馬小型豬在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2014, 22(1): 94-98.

[16] 蘭琴, 王竹林, 曹浩, 等. 改良左旋支結(jié)扎法微創(chuàng)小型豬急性心肌梗死模型建立與評(píng)估 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2017, 25(4): 414-419.

[17] 楊濤濤, 肖穎, 奚賽飛, 等. 大鼠心肌梗死模型構(gòu)建和評(píng)價(jià)方法的改良 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 24(2): 46-51, 4.

[18] 吳敏, 朱杰, 賈明明, 等. 鈣離子與氧自由基誘導(dǎo)損傷豬心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 [J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2014, 35(5): 62-67.