馬 芹，王元智，陸濤峰，李智昊，楊春文，陳洪巖*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150009； 2.牡丹江師范學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

在野生嚙齒類動(dòng)物棕背鼠 平(Myodesrufocanus)的生態(tài)學(xué)研究中，對(duì)其進(jìn)行性別鑒別是分析其種群動(dòng)態(tài)的一項(xiàng)基本工作[1]。因棕背鼠 平是流行性出血熱病毒、森林腦炎病毒及普馬拉病毒等人獸共患病病原體的天然宿主[2-3]，本實(shí)驗(yàn)室已開(kāi)展棕背鼠 平的實(shí)驗(yàn)室繁育[4]，擬將其培育成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以便構(gòu)建人獸共患病感染動(dòng)物模型，同時(shí)豐富實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源。但在其實(shí)驗(yàn)室繁育過(guò)程中，因其性別不易判斷，嚴(yán)重影響著分籠與繁殖。目前對(duì)棕背鼠 平的性別鑒定多依據(jù)肛門到尿生殖孔的距離及被毛、性情、乳頭及外部生殖器官等指標(biāo)[5-6]進(jìn)行判斷(圖1)，但棕背鼠 平活動(dòng)敏捷、性情不溫順，不易抓??；幼齡時(shí)期的棕背鼠 平外部生殖器官又未顯現(xiàn)，不能從外表準(zhǔn)確區(qū)分雌雄；從肛門到尿生殖孔的距離及被毛進(jìn)行觀察，主觀性較強(qiáng)，很難做到正確的性別分離。

注：A：4周齡；B：成年雄性；C：成年雌性。圖1 棕背鼠 平性別的表型判斷Note. A: A 4-week-old grey red-backed vole; B: An adult male grey red-backed vole; C: An adult female grey red-backed vole.Fig.1 Phenotypic identification of the gender of grey red-backed voles

隨著對(duì)性別決定理論的深度研究，用于動(dòng)物性別鑒定的方法也在同步發(fā)展，尤其在分子生物學(xué)領(lǐng)域取得了較大進(jìn)展。Page等[7]發(fā)現(xiàn)在Y染色體上存在一種可編碼鋅指蛋白的高度保守的基因序列，即鋅指結(jié)構(gòu)基因(zinc-finger Y，ZFY)，該序列可能與性別決定有關(guān)；Schneider-G?dicke[8]在哺乳動(dòng)物X染色體上也發(fā)現(xiàn)了與ZFY高度同源的基因，即ZFX基因，在無(wú)ZFY表達(dá)的小鼠上，睪丸的分化不受影響，因此，ZFY/ZFX基因不能決定性別。Sinclair等[9]發(fā)現(xiàn)在Y染色體短臂靠近常染色體的35 kb區(qū)域存在性別決定區(qū)(sex-determining region of the Y chromosome)，即SRY基因。Koopman等[10]將SRY基因注入到雌性小鼠胚胎中，后期小鼠發(fā)育成雄性，證明了SRY基因?yàn)椴溉閯?dòng)物的性別決定基因。目前已在東北虎、黑熊、貓、牛等動(dòng)物[1, 11-13]上用SRY基因進(jìn)行了性別鑒定，正確率100%。本實(shí)驗(yàn)在棕背鼠 平實(shí)驗(yàn)室繁育研究[4]的基礎(chǔ)上，利用PCR技術(shù)，以棕背鼠 平的新鮮毛囊為實(shí)驗(yàn)材料，從毛囊中提取DNA，利用SRY基因和ZFY/ZFX基因的雙重PCR擴(kuò)增對(duì)棕背鼠 平的性別進(jìn)行鑒定，建立一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的性別鑒定方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

于黑龍江省牡丹江地區(qū)牡丹峰林地捕獲的野生棕背鼠 平若干只，經(jīng)隔離檢疫后，飼養(yǎng)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所負(fù)壓隔離環(huán)境感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi) [SYXK (黑) 2017-009]，選取6只雄性成年、3只雌性成年及14只4周齡左右棕背鼠 平用于PCR方法鑒定棕背鼠 平性別；10只SPF級(jí)Wistar大鼠(5只雄性，體重310～320 g；5只雌性，體重230～240 g；9周齡)和8只SPF級(jí)BALB/c小鼠(5只雌性和3只雄性，體重21～23 g，6周齡)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司 [SCXK (京) 2016-0011]，飼養(yǎng)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所負(fù)壓隔離環(huán)境感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

Chelex-100 resin購(gòu)于Sigma公司，蛋白酶K和2× EasyTaq SuperMix購(gòu)于全式金生物技術(shù)有限公司，PCR儀購(gòu)于杭州博日科技有限公司，DK-8D型電熱恒溫水槽購(gòu)于上海精宏實(shí)驗(yàn)有限公司，凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)于北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，其他常規(guī)試劑為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 棕背鼠 平基因組DNA的提取

用鑷子夾取棕背鼠 平被毛，挑選帶有毛囊的5根，保留被毛根部，剪去其余部分，放入0.5 mL EP管中，加入0.3 mL ddH2O洗一次，然后加入30 μL 5%的Chelex-100和5 μL 5 mg/mL的蛋白酶K，置于56℃恒溫水浴保溫6 h。取出后振蕩，100℃保溫8 min，充分振蕩，13 000 r/min離心3 min，DNA存在于上清中，-20℃保存上清備用。

1.3.2 引物合成

[14]設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增ZFY/ZFX基因片段的引物：P1∶5’-ATAATCACATGGAGAGCCACAA GCT-3’，P2∶5’-GCACTTCTTTGGTATCTGAGAAA GT-3’；針對(duì)鼠的SRY基因設(shè)計(jì)并合成用于性別鑒定的引物：P3∶5’-TGTGGTCTCGTGGTCAGAGG-3’，P4∶5’-CGGCTTCTGTAAGGCGTTTC-3’。引物均由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

以提取的毛囊DNA為模板，分別構(gòu)建ZFY/ZFX基因和SRY基因PCR擴(kuò)增體系50 μL：2× EasyTaq PCR SuperMix 25 μL，DNA模板1 μg，P1(P3)引物1 μL，P2(P4)引物1 μL，ddH2O 22 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增條帶大小與目的條帶一致時(shí)進(jìn)行測(cè)序分析。

1.3.4 雙重PCR擴(kuò)增

將擴(kuò)增ZFY/ZFX基因和SRY基因的引物同時(shí)加入到一個(gè)PCR反應(yīng)體系內(nèi)，建立雙重PCR擴(kuò)增方法。擴(kuò)增體系為：2× EasyTaq PCR SuperMix 25 μL，DNA模板1 μg，P1引物1 μL，P2引物1 μL，P3引物0.6 μL，P4引物0.6 μL，ddH2O 20.6 μL。反應(yīng)程序同PCR擴(kuò)增。同時(shí)優(yōu)化退火溫度、引物濃度及瓊脂糖凝膠濃度，確定最佳的雙重PCR擴(kuò)增條件。當(dāng)擴(kuò)增片段僅有一個(gè)(ZFY/ZFX445/447 bp)時(shí)，說(shuō)明該棕背鼠 平不存在SRY基因位點(diǎn)，性別為雌性；當(dāng)擴(kuò)增片段有兩個(gè)(ZFY/ZFX445/447 bp和SRY108 bp)時(shí)，說(shuō)明該棕背鼠 平的性別為雄性；當(dāng)沒(méi)有擴(kuò)增片段時(shí)，說(shuō)明PCR擴(kuò)增體系構(gòu)建失敗，不能對(duì)棕背鼠 平的性別進(jìn)行鑒定。

1.3.5 性別鑒定

選取23只棕背鼠 平(表型判斷為6只雄性，3只雌性，其余鼠性別經(jīng)解剖結(jié)果進(jìn)行判斷)、10只Wistar大鼠(5只雄性，5只雌性)和8只BALB/c小鼠(3只雄性，5只雌性)，獲取其帶有毛囊的新鮮被毛，Chelex-100提取基因組DNA。利用上述建立的雙重PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行性別鑒定。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增

選取雄性、雌性棕背鼠 平各一只，利用Chelex-100提取毛囊中DNA，分別以雄、雌DNA為模板，P1和P2為引物建立PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增ZFY/ZFX基因片段，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，雌、雄性棕背鼠 平均有擴(kuò)增條帶(圖2)，片段大小與ZFY/ZFX目的片段一致，經(jīng)測(cè)序后分析為ZFX基因。同時(shí)，以P3和P4為引物，擴(kuò)增SRY基因片段，結(jié)果顯示雄性有與SRY基因目的片段大小一致的條帶，測(cè)序分析為鼠的SRY基因，而雌性未擴(kuò)增出條帶(圖2)。

注：M：DL 2000 DNA Marker；泳道1和2：ZFY/ZFX基因擴(kuò)增；泳道3和4：SRY基因擴(kuò)增。泳道1和3：雌性棕背鼠 平；泳道2和4：雄性棕背鼠 平。圖2 棕背鼠 平SRY基因和ZFY/ZFX基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Note. M: DL 2000 DNA Marker; Lane 1 and 2: PCR products of the ZFY/ZFX gene; Lane 3 and 4: PCR products of the SRY gene. Lane 1 and 3: Female voles; Lane 2 and 4: Male voles.Fig.2 PCR amplification products of the SRY and ZFY/ZFX genes in grey red-backed voles

2.2 雙重PCR擴(kuò)增

分別以雄性、雌性棕背鼠 平毛囊DNA為模板，構(gòu)建ZFY/ZFX基因和SRY基因雙重PCR擴(kuò)增體系，結(jié)果顯示雄性可擴(kuò)增出兩條片段(ZFX445 bp和SRY108 bp)；而雌性只擴(kuò)增出一條片段(ZFX445 bp)，未擴(kuò)增出SRY基因片段；陰性對(duì)照無(wú)條帶(圖3)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3次，擴(kuò)增結(jié)果一致，穩(wěn)定性較好，雙重PCR擴(kuò)增體系構(gòu)建成功。通過(guò)對(duì)擴(kuò)增條件的優(yōu)化，退火溫度為55℃時(shí)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠電泳下觀察效果最佳。

注：M：DL 2000 DNA Marker；泳道1～3：分別為陰性對(duì)照、雄性棕背鼠 平、雌性棕背鼠 平。圖3 雌、雄性棕背鼠 平SRY基因和ZFY/ZFX基因的雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果Note. M: DL 2000 DNA Marker; Lane 1-3: Negative control, male and female grey red-backed voles, respectively.Fig.3 Amplification products of the SRY and ZFY/ZFX genes in male and female grey red-backed voles by the double PCR assay

2.3 性別鑒定

獲取23只棕背鼠 平、10只Wistar大鼠及8只BALB/c小鼠的新鮮毛囊，提取基因組DNA，利用本實(shí)驗(yàn)建立的ZFY/ZFX基因和SRY基因雙重PCR擴(kuò)增方法，對(duì)23只棕背鼠 平進(jìn)行性別鑒定，結(jié)果(圖4)顯示前9只已知性別的棕背鼠 平檢測(cè)結(jié)果與表型判斷

一致，其中6只同時(shí)擴(kuò)增出ZFY/ZFX基因和SRY基因片段，為雄性；3只僅擴(kuò)增出ZFY/ZFX基因片段，沒(méi)有擴(kuò)增出SRY基因片段，為雌性；其余未知性別的14只棕背鼠 平，鑒定為結(jié)果顯示7只為雄性，7只為雌性，與解剖結(jié)果一致(圖5)。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示10只Wistar大鼠中5只為雄性，5只為雌性；8只BALB/c小鼠中5只為雌性，3只為雄性，與解剖結(jié)果一致，說(shuō)明建立的雙重PCR擴(kuò)增方法同樣適用于大鼠和小鼠的性別鑒定。

3 討論

對(duì)動(dòng)物進(jìn)行性別鑒定時(shí)，大多數(shù)PCR方法以動(dòng)物的組織為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)于一些性情兇猛、活動(dòng)敏捷、不易抓取和固定的動(dòng)物，獲取其組織材料比較困難。另外，從動(dòng)物福利的角度出發(fā)，我們應(yīng)盡量減少對(duì)動(dòng)物的傷害。已有文獻(xiàn)證實(shí)以動(dòng)物被毛為材料進(jìn)行性別鑒定是完全可靠的，正確率100%[1]。本實(shí)驗(yàn)以棕背鼠 平的被毛為實(shí)驗(yàn)材料，利用Chelex-100提取毛囊中的DNA，并以提取的DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，該方法不僅不損害研究對(duì)象，采樣和DNA的提取也更加快捷，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，還可以降低實(shí)驗(yàn)成本。

注：M：DL 2000 DNA Marker；泳道1和35：陰性對(duì)照；泳道2～24：分別為棕背鼠 平樣品1～23；泳道25～34：分別為Wistar大鼠樣品1～10；泳道36～43：分別為BALB/c小鼠樣品1～8。圖4 棕背鼠 平、Wistar大鼠和BALB/c小鼠的性別鑒定Note. M: DL 2000 DNA Marker; Lane 1 and 35: Negative control; Lane 2-24: Samples 1-23 taken from grey red-backed voles, respectively; Lane 25-34: Samples 1-10 taken from Wistar rats, respectively; Lane 36-43: Samples 1-8 taken from BALB/c mice, respectively.Fig.4 Gender identification of the grey red-backed voles, Wistar rats and BALB/c mice

注：A：雌性；B：雄性。圖5 棕背鼠 平性別的解剖結(jié)果Note. A: Female; B: Male.Fig.5 Autopsy results demonstrating the gender identification of grey red-backed voles

與常規(guī)PCR方法(只針對(duì)雄性特異性基因進(jìn)行一次擴(kuò)增)不同，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了ZFY/ZFX基因和SRY基因的雙重PCR擴(kuò)增，以ZFY/ZFX基因作為PCR擴(kuò)增的內(nèi)參照，防止因PCR擴(kuò)增SRY基因失敗造成假陰性，該方法提高了準(zhǔn)確率，同時(shí)也增加了

模板的利用率。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)ZFY/ZFX基因和SRY基因建立的雙重PCR方法，能夠?qū)ψ乇呈?平的性別做出正確判斷，具有快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于野生動(dòng)物研究領(lǐng)域以及實(shí)驗(yàn)室繁育中的性別鑒定。該方法也可能存在一些局限性，對(duì)一些性別與正常情況不同，如Y染色體SRY基因缺失個(gè)體、染色體組型為XXY、XXX等個(gè)體，該方法不能做出正確鑒定，但這種情況在自然狀態(tài)下發(fā)生的幾率非常小[1]，可以忽略。通過(guò)利用針對(duì)ZFY/ZFX基因和SRY基因建立的雙重PCR擴(kuò)增方法，可以對(duì)棕背鼠 平的性別做出正確判斷，合理安排分籠和繁殖，將對(duì)棕背鼠 平的實(shí)驗(yàn)室繁育有重要影響。

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