段 淼，曹云濤，王旭芹

(貴州省遵義市第一人民醫(yī)院新生兒科，貴州 遵義 563002)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是造成新生兒死亡及神經(jīng)后遺癥的主要原因之一[1]，目前無特殊治療辦法。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種多功能性的細(xì)胞因子，除能促進紅細(xì)胞生成外，還對多種腦損傷模型有神經(jīng)保護作用[2-4]。巢蛋白(neuroepithelial stem cell protein，nestin)是胚胎形成早期神經(jīng)上皮細(xì)胞內(nèi)的一種中間絲蛋白，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生病理性損傷之后再生時廣泛表達于神經(jīng)系統(tǒng)，因此巢蛋白表達常用作判定神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病損后能否促進神經(jīng)細(xì)胞再生的標(biāo)志物。本研究擬建立新生大鼠HIE模型，外源性給予EPO，通過檢測海馬區(qū)的巢蛋白表達水平來探討EPO對新生鼠HIE的保護作用。此外，腸道與腦通過神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)的互作形成腸-腦軸[5]，本實驗還將通過高通量測序的方法，分析EPO處理前后大鼠的腸道微生物菌群變化，旨在觀察腸道菌落多樣性變化與新生鼠HIE的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠48只，雌雄不限，體重13～16 g，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所動物室提供 [SCXK (渝) 2012-0001]。飼養(yǎng)的環(huán)境溫度：(22±2) ℃，相對濕度50%～60%，光照12 h/12 h明暗交替，每籠5只飼養(yǎng) [SYXK (渝) 2017-0012]。

1.2 主要試劑與儀器

重組人促紅素注射液：3000 IU/支，購自哈藥集團生物工程有限公司，產(chǎn)品批號：S20050090；rabbit anti-nestin：博士德生物工程有限公司，編號：BA0056；QIAamp FAST DNA Stool Mini Kit：德國Qiagen；緩沖液：buffer AW1，buffer AW2，buffer ATE，德國Qiagen。顯微鏡：Leica DM4000B；防脫磨砂載玻片：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Leica Qwin細(xì)胞圖像分析儀：德國Leica公司；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件：美國Media Cybernetics公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型建立

參照改良Rice-Vannuncci法建立模型[6]，在乙醚吸入麻醉狀態(tài)下，消毒切開頸部皮膚，分離右側(cè)頸總動脈結(jié)扎剪斷，縫合切口，術(shù)后放入37℃恒溫箱中30 min，以1.5 L/min輸入含8% O2和92% N2的低氧氣源2.5 h。

1.3.2 實驗分組及給藥[7]

隨機分為HIE模型組和EPO實驗組，分別給予相應(yīng)劑量的EPO和生理鹽水。對照組16只，僅分離右側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎，不干預(yù)。HIE模型組16只大鼠，缺氧缺血術(shù)后正常飼養(yǎng)，與EPO治療在相同時間按體重給予相應(yīng)體積生理鹽水；EPO實驗組16只，術(shù)后30 min內(nèi)腹腔注射EPO [5 IU/(kg·d)]，均連用14 d。三組大鼠于術(shù)后第14、21天(每個時點8只)用4%多聚甲醛心臟注射處死，暴露心臟后迅速注入5～10 mL生理鹽水，盡量沖洗循環(huán)血液。剪下頭顱，沿頭顱中線剪開皮膚和顱骨，取出腦組織放入4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，切片機沿海馬冠狀切片備用。同時收集對照組和HIE模型組兩組的糞便顆粒于無菌管中，貯存在-80℃冰箱備用。實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.3.3 腦組織切片免疫組織化學(xué)染色

對三組新生大鼠術(shù)后14 d、21 d大腦海馬組織連續(xù)冠狀切片，隔5取1，HE染色觀察右側(cè)海馬CA1區(qū)病理改變，免疫組織化學(xué)SABC法檢測右側(cè)海馬區(qū)nestin陽性細(xì)胞，按操作規(guī)程進行。

1.3.4 海馬區(qū)nestin表達的檢測

采用Leica DM2500顯微鏡及Leica Qwin軟件觀察、計數(shù)nestin陽性細(xì)胞。每個標(biāo)本隨機挑選3張切片、每張切片隨機選擇4個視野進行陽性細(xì)胞觀察及計數(shù)，每個標(biāo)本共12個視野，取其平均值。

1.3.5 糞便DNA制備和微生物群落分析

稱取糞便樣本180～220 mg至2 mL離心管中，按照QIAamp FAST DNA Stool Mini Kit試劑盒說明書提取細(xì)菌DNA，送上海美吉生物公司按指定測序區(qū)域進行PCR擴增及MiSeq測序，進行生物信息學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 成功復(fù)制新生大鼠缺氧缺血性腦病模型

2.1.1 參照孫金嶠等建模評分標(biāo)準(zhǔn)[8]分析各組行為特征

實驗組和模型組術(shù)后2 h內(nèi)呼吸節(jié)律改變，活動減少，3～4 d后側(cè)推抵抗力減弱，出現(xiàn)旋尾動作，3周之后好轉(zhuǎn)，活動正常。

2.1.2 HE染色

對照組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)緊密，細(xì)胞核清晰；實驗組腦組織結(jié)構(gòu)較對照組變得疏松，核仁不清晰；模型組腦組織嚴(yán)重?fù)p傷，細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，部分存活神經(jīng)元壞死，細(xì)胞核溶解。見圖1。

2.2 Nestin在海馬DG區(qū)的表達變化

對照組陽性細(xì)胞數(shù)目少，EPO實驗組的陽性細(xì)胞數(shù)目與對照組、HIE模型組相比明顯增多，不同時點之間比較差異有顯著性(P< 0.05)。HIE模型組術(shù)后第14天海馬DG區(qū)nestin表達增加，與對照組比較差異有顯著性(P< 0.05)，術(shù)后14 d、21 d海馬DG區(qū)的nestin在各組間的表達均差異有顯著性(P< 0.05)，實驗組表達最多，HIE模型組次之，對照組最少。見圖2、圖3。

注：A：對照組；B：HIE模型組；C：EPO實驗組。圖1 新生大鼠缺氧缺血性腦病模型海馬CA1區(qū)病理改變(HE染色，× 400)Note. A: Control group; B: HIE model group; C: EPO experimental group.Fig.1 Pathological changes in the hippocampal CA1 area of neonatal rats with HIE. HE staining

注：A：對照組；B：HIE模型組；C：EPO實驗組。圖2 新生SD大鼠術(shù)后海馬區(qū)的nestin表達水平(免疫組織化學(xué)染色，× 400)Note. A: Control group; B: HIE model group; C: EPO experimental group.Fig.2 Expression levels of nestin in the hippocampus of neonatal SD rats after EPO treatment. Histoimmunochemical staining

注：與對照組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05。圖3 新生SD大鼠海馬區(qū)nestin在14 d、21 d時的表達變化Note. Compared with the control group,*P < 0.05. Compared with the model group,#P < 0.05.Fig.3 Changes in the expression level of nestin in the hippocampus of neonatal SD rats at 14 d and 21 d

2.3 腸道微生物菌群相對豐度的變化

根據(jù)可操作分類單元(operational taxonomic units，OTU，是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元設(shè)置的統(tǒng)一標(biāo)志)在門水平上分析出5種細(xì)菌種類，包括放線菌門、擬桿菌門、藍藻門、脫鐵菌門和厚壁菌門。模型組與對照組的菌群結(jié)構(gòu)比較差異無顯著性，未發(fā)現(xiàn)兩組在菌群上的明顯變化。見表1。

2.4 微生物群落Shannon指數(shù)比較

香農(nóng)-威納指數(shù)(Shannon-Wiener index)是用來估算樣本中微生物多樣性的參數(shù)之一。Shannon值越大，說明群落多樣性越高。Shannon指數(shù)比較結(jié)果表明，HIE模型組較對照組呈降低趨勢，兩組比較菌群多樣性有顯著性(P< 0.05)。見表2。

表1 在門的水平上整體的群落結(jié)構(gòu)差異(OTU)

注：模型組與對照組相比，P> 0.05，差異無顯著性。

Note. The model group vs. the control group,P> 0.05, showing non-significant differences.

表2 Shannon指數(shù)比較

注：與對照組比較，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

3 討論

近來有關(guān)動物缺氧缺血性腦損傷模型的制作方法推陳出新，總結(jié)國內(nèi)研究動物模型現(xiàn)大致有以下幾種：①脂多糖(lipopolysaccharide)等神經(jīng)毒素誘導(dǎo)的[9]；②注射神經(jīng)毒素聯(lián)合缺氧缺血制成的[10]；③缺氧缺血的，這種模型有兩種制作手段，其一是夾閉臨產(chǎn)孕鼠的雙側(cè)子宮動脈，造成新生乳鼠宮內(nèi)缺氧缺血的狀態(tài)；其二是將幼鼠放入極度缺氧中制成腦癱模型，或?qū)⒂资髥蝹?cè)頸總動脈阻斷，再置于缺氧環(huán)境中制成腦癱模型[11]。本實驗在借鑒了國內(nèi)外經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，采用的是將SD新生大鼠單側(cè)頸總動脈結(jié)扎并缺氧制作模型，有文獻報道選擇將臨產(chǎn)的孕鼠子宮動脈夾閉的方式制作缺血缺氧的模型較簡單易行[12]。近年來也有學(xué)者用昆明小鼠進行頸動脈結(jié)扎缺氧制備模型[13]。

巢蛋白是第VI類中間絲蛋白，主要在神經(jīng)和肌肉的干細(xì)胞中表達；隨著細(xì)胞分化成熟，逐漸減低，最后消失[14]。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損傷時，nestin的表達重新升高[15-16]，因此，nestin可作為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物。本研究通過制備7日齡新生大鼠HIE模型，設(shè)置對照組、HIE模型組、EPO實驗組，分別檢測三組大鼠術(shù)后第14、21天海馬DG區(qū)nestin的表達，提示EPO可促進nestin的表達。

人體內(nèi)的微生物生態(tài)系統(tǒng)對人類的健康有著深遠(yuǎn)的影響[17]，有學(xué)者稱腸道菌群為宿主內(nèi)部的“微生物器官”，認(rèn)為腸道菌群是一個新的人體生理系統(tǒng)?，F(xiàn)國內(nèi)外對腸道菌群的研究已成為熱點，大量實驗證明腸道菌群與各種疾病是有關(guān)聯(lián)的，但具體的作用機制尚未闡明[18-20]。通過對腸道菌群的深入研究，許多學(xué)者已證實腸道微生物群的變化可以對腸-腦軸進行調(diào)節(jié)，在神經(jīng)發(fā)育、老化及神經(jīng)退行性病變中起重要作用[21-22]，同時有不少學(xué)者認(rèn)為菌群也可以調(diào)節(jié)鼠的海馬神經(jīng)發(fā)生，并已用實驗證實發(fā)表[23]。本研究通過對比HIE模型組與對照組糞便中菌群多樣性的變化揭示了腸道菌群組成的改變可能與缺氧缺血性腦病的發(fā)病相關(guān)，HIE模型組Shannon指數(shù)較對照組呈降低趨勢，細(xì)菌多樣性明顯低于對照組，為腸-腦軸的存在提供了實驗證據(jù)，但本實驗并未分析出菌群的差異性變化，這可能與鼠便不能完全覆蓋腸道內(nèi)的所有菌群有關(guān)，如果采集小腸組織進行研究，可能更能反映腸道菌群的變化。

總之，本實驗建立了新生大鼠缺氧缺血性腦病的模型，并研究了促紅細(xì)胞生成素的神經(jīng)保護作用以及腸-腦軸存在的實驗依據(jù)。

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