崔雪陽(yáng) 綜述 邢承忠 審校

惡性腫瘤的發(fā)生主要是由于調(diào)控細(xì)胞增殖、分化的基因不斷變異累積造成。一直以來(lái)，組織標(biāo)本是癌癥診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，也是確定預(yù)后以及監(jiān)測(cè)治療的基石。通過(guò)組織樣本獲取的腫瘤分子表達(dá)譜不能反復(fù)獲得，只能提供腫瘤異質(zhì)性的“快照”，且分子譜常隨著疾病的進(jìn)展而發(fā)生變化。在癌癥進(jìn)展和治療過(guò)程中，由于內(nèi)源性及外源性的選擇壓力作用，腫瘤細(xì)胞的多個(gè)亞克隆種群相互競(jìng)爭(zhēng)，促進(jìn)優(yōu)勢(shì)子克隆體出現(xiàn)，而這些克隆體具有復(fù)制及轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)、治療敏感性差等特點(diǎn)，最終導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展及耐藥發(fā)生[1-3]。

在腫瘤精準(zhǔn)治療時(shí)代，有限的組織標(biāo)本不能及時(shí)了解所有的腫瘤基因組變化，這可能錯(cuò)失治療良機(jī)。而近年來(lái)引起極大關(guān)注的“液體活檢”(Liquid biopsy，LB)可能會(huì)彌補(bǔ)這些不足。本文將針對(duì)結(jié)直腸癌領(lǐng)域的液體活檢進(jìn)行簡(jiǎn)要概括。

1 液體活檢的生物學(xué)基礎(chǔ)

液體活檢技術(shù)主要通過(guò)無(wú)創(chuàng)手段提取血液、尿液、唾液、胸腔積液、腦脊液甚至糞便等，而這些體液都已經(jīng)被證實(shí)包含腫瘤來(lái)源的基因物質(zhì)?，F(xiàn)有研究證實(shí)[4-6]，液體活檢能夠測(cè)定癌癥患者的基因譜、監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)、評(píng)估耐藥性的發(fā)生、量化微小殘留病灶。

1.1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cells，CTCs)

CTCs最早于1896年由澳大利亞的Thomas Ashworth在轉(zhuǎn)移性腫瘤患者血液中發(fā)現(xiàn)，但是直到近15年才引起廣泛關(guān)注。CTCs主要指腫瘤患者原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶釋放入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，可以以單個(gè)細(xì)胞或者細(xì)胞簇形式存在[7]，通常CTCs濃度很低，在大多數(shù)腫瘤患者中，每10 mL外周血中能夠分離出1～10個(gè)細(xì)胞[8]。目前分離CTCs的技術(shù)多種多樣，例如，CTCs可以通過(guò)其大小及生物、物理性質(zhì)進(jìn)行陰性富集，或者通過(guò)這些細(xì)胞表面常表達(dá)的生物標(biāo)志物，如上皮細(xì)胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)來(lái)進(jìn)行陽(yáng)性富集[9]?，F(xiàn)有研究證實(shí)CTCs與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且CTCs的數(shù)量與治療效果及總生存期呈負(fù)相關(guān)[7]。即使在原發(fā)灶尚未出現(xiàn)癥狀之前，CTCs也極有可能在遠(yuǎn)處停留，并處于休眠狀態(tài)，一段時(shí)間之后，休眠的細(xì)胞被重新激活，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移，但其機(jī)制目前尚不清楚[10]。

1.2 循環(huán)腫瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)

ctDNA是壞死或凋亡的腫瘤細(xì)胞釋放入外周血的DNA片段，主要來(lái)源于原發(fā)性腫瘤、CTCs、微轉(zhuǎn)移灶及轉(zhuǎn)移灶。ctDNA包含與其同源腫瘤細(xì)胞相同的基因缺陷，例如點(diǎn)突變、基因重組、擴(kuò)增甚至基因拷貝數(shù)的變異等[11]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每天大約有3%的腫瘤DNA進(jìn)入外周血循環(huán)中，而從腫瘤細(xì)胞中獲得的ctDNA的比例差別較大(1.4%～47.9%)，這在很大程度上取決于腫瘤的大小和分期[12]。并且，一旦進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，ctDNA通過(guò)肝臟、腎臟等快速清除，半衰期從16分鐘到數(shù)小時(shí)，雖然這帶來(lái)檢測(cè)上的挑戰(zhàn)，但是能夠反映腫瘤的實(shí)時(shí)變化狀態(tài)[11]。

1.3 外泌體

外泌體是一類直徑為40～100 nm的胞外盤(pán)狀囊泡，可由血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血小板及平滑肌細(xì)胞等通過(guò)內(nèi)分泌及旁分泌的方式釋放到多種體液中，進(jìn)而影響臨近細(xì)胞及遠(yuǎn)處區(qū)域的生物學(xué)行為及功能。其內(nèi)容物包括蛋白質(zhì)、脂類、DNA、mRNA、miRNA及LncRNA等，通過(guò)調(diào)節(jié)受體細(xì)胞活性，在細(xì)胞通信及物質(zhì)運(yùn)輸方面發(fā)揮重要作用[13]。并且，腫瘤來(lái)源的外泌體可以調(diào)節(jié)宿主微環(huán)境，刺激新生血管形成、增強(qiáng)腫瘤侵襲能力，最終導(dǎo)致疾病進(jìn)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[14]。

1.4 基于腫瘤血小板的RNA測(cè)序

腫瘤血小板(Tumor-educated blood platelets，TEPs)是腫瘤相關(guān)生物學(xué)信息的另一種來(lái)源，作為全身及局部反應(yīng)的中心分子，與腫瘤細(xì)胞相互作用，改變RNA表達(dá)譜，進(jìn)而影響腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。Best等[15]研究者對(duì)不同類型的局部和轉(zhuǎn)移性腫瘤患者及健康個(gè)體進(jìn)行TEPs的RNA測(cè)序，結(jié)果提示其區(qū)分腫瘤的準(zhǔn)確率達(dá)到96%，并且可以區(qū)分6種不同類型腫瘤，其判斷原發(fā)腫瘤位置準(zhǔn)確率達(dá)71%。因此，TEPs作為一種新興的液體活檢，可用于泛腫瘤分析、區(qū)分腫瘤類型以及腫瘤基因突變的診斷。

2 液體活檢與結(jié)直腸癌的研究熱點(diǎn)

2.1 在結(jié)直腸癌診斷中的作用

研究表明液體活檢技術(shù)因其非侵入性、敏感性高等優(yōu)勢(shì)，結(jié)合不同的生物學(xué)標(biāo)志物，可用于結(jié)直腸癌的早期診斷。目前，臨床最普遍快捷的篩查結(jié)直腸癌的方式是便潛血試驗(yàn)及糞便免疫化學(xué)試驗(yàn)，雖然這兩種非侵入性方法都有助于降低結(jié)直腸癌的死亡率，但是特異性及敏感性較低[16]。Bettegowda等[17]通過(guò)數(shù)字PCR技術(shù)(Digital PCR，dPCR)發(fā)現(xiàn)100%的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能夠檢測(cè)到ctDNA，而非轉(zhuǎn)移性患者的檢測(cè)率達(dá)73%。霍普金斯癌癥中心通過(guò)新型的CancerSEEK方法，能對(duì)16個(gè)癌癥基因突變及10種循環(huán)中的蛋白標(biāo)記濃度進(jìn)行評(píng)估。對(duì)1 005名已被診斷罹患8種常見(jiàn)類型癌癥的I～I(xiàn)II期患者以及812名健康對(duì)照者進(jìn)行了研究；CancerSEEK檢測(cè)到癌癥的敏感性為69%～98%，特異性為99%。因此，CancerSEEK方法有利于癌癥的早期發(fā)現(xiàn)，降低死亡率[18]。

多項(xiàng)試驗(yàn)證實(shí)外泌體包含的miRNA及蛋白組分的敏感性及特異性明顯高于目前臨床中應(yīng)用的腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9。最近，Ogata等[19]分析對(duì)比了結(jié)直腸癌患者與健康人群血清中16種外泌體來(lái)源的miRNA，其中l(wèi)et-7a、miR-21、miR-23a、miR-150、miR-223、miR-1229、miR-1246含量在患者血清中顯著升高，而手術(shù)切除后這些miRNA水平下調(diào)，并且miR-23a和miR-1246檢測(cè)早期結(jié)直腸癌敏感性分別為95%、90%。采用高度敏感的ExoScreen分析技術(shù)，檢測(cè)到結(jié)直腸癌細(xì)胞系外泌體表面存在膜蛋白CD147，并在患者血漿外泌體中得到相同結(jié)果，預(yù)示著CD147可能在未來(lái)成為早期診斷結(jié)直腸癌的指標(biāo)[20]。

2.2 在結(jié)直腸癌預(yù)后中的作用

液體活檢不僅能夠早期診斷結(jié)直腸癌，而且可以評(píng)估疾病復(fù)發(fā)、預(yù)后及轉(zhuǎn)移。在腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，CTCs的存在可能是最早的亞臨床階段。一項(xiàng)對(duì)95例非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者進(jìn)行2年術(shù)后隨訪的研究顯示，CTCs基線數(shù)量≥5的患者在根治性術(shù)后1年內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的比率是CTCs<5的8倍，這意味著CTCs可以作為無(wú)病進(jìn)展生存期及總生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[21]。另一項(xiàng)研究分析194名晚期肝轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，CTCs陽(yáng)性與不可切除的肝轉(zhuǎn)移瘤密切相關(guān)，這也提示CTCs能夠影響肝轉(zhuǎn)移瘤的治療決策[22]。

Reinert等[23]開(kāi)發(fā)了一項(xiàng)基于ctDNA的個(gè)性化檢測(cè)方法，并通過(guò)dPCR技術(shù)評(píng)估量化了6位復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌及5位非復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌患者血漿的ctDNA及體細(xì)胞結(jié)構(gòu)變異水平，研究結(jié)果證實(shí)ctDNA與傳統(tǒng)的隨訪方法相比，可以提前10個(gè)月檢測(cè)到腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)，其敏感性及特異性達(dá)100%。因此，對(duì)于根治性手術(shù)后的非轉(zhuǎn)移患者而言，ctDNA能夠在影像學(xué)及臨床證實(shí)復(fù)發(fā)之前，捕捉和監(jiān)測(cè)微小殘留病灶，并通過(guò)基因組的改變?cè)缙陬A(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)。

血清中外泌體來(lái)源的miR-19a及miR-17-92基因簇的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，并且miR-19a的高水平表達(dá)也預(yù)示著疾病進(jìn)展及預(yù)后不良[24]。而外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了整合素α6β4、α6β1與肺轉(zhuǎn)移相關(guān)，αvβ5與肝轉(zhuǎn)移有關(guān)，這也表明不同的整合素表達(dá)模式可以預(yù)測(cè)器官特異性轉(zhuǎn)移[25]。另一項(xiàng)研究表明，外泌體來(lái)源的miR-200家族表達(dá)缺失，將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞更容易侵入血管及淋巴管，并且在5-氟尿嘧啶耐藥的細(xì)胞系中同樣觀察到外泌體分泌的miR-200家族表達(dá)水平下降。這提示了外泌體miR-200家族的缺失，將導(dǎo)致腫瘤侵襲性增加，更易耐藥[26]。

2.3 在結(jié)直腸癌治療中的作用

在臨床實(shí)踐中，Ⅱ期結(jié)直腸癌化療帶來(lái)的絕對(duì)生存獲益有限以及引起諸多不良反應(yīng)，導(dǎo)致Ⅱ期結(jié)直腸癌是否需要化療一直存在爭(zhēng)議。一項(xiàng)關(guān)于Ⅱ期結(jié)腸癌術(shù)后患者的前瞻性研究指出，在未接受輔助化療的178名患者中，14名在術(shù)后檢測(cè)到ctDNA，其中11人(占79%)在27個(gè)月的隨訪中復(fù)發(fā)，而其余164名ctDNA陰性患者中，僅有16例復(fù)發(fā)(HR=18，95%CI：7.9～40)。另一組接受化療的患者，化療結(jié)束后ctDNA的存在同樣降低了無(wú)復(fù)發(fā)生存率(HR=11，95%CI：1.8～68)。所以，在Ⅱ期結(jié)腸癌切除術(shù)后，ctDNA可以為微小殘留病灶提供直接證據(jù)，同時(shí)識(shí)別發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高的患者，有助于制定輔助治療決策[27]。

在局部晚期直腸癌(Locally advanced rectal cancer，LARC)治療領(lǐng)域，CTCs計(jì)數(shù)及參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，Treg)可以評(píng)估預(yù)測(cè)新輔助治療的腫瘤客觀反應(yīng)情況。研究認(rèn)為如果CTCs檢測(cè)陽(yáng)性則應(yīng)建議患者接受更強(qiáng)的新輔助治療方案(如誘導(dǎo)化療)[28]。另外，直腸癌患者外周血中Treg含量明顯高于健康人群，而新輔助放療后存在不同程度的下降，并且與放療劑量相關(guān)。初步數(shù)據(jù)顯示，新輔助治療5天后，Treg含量高的LARC患者腫瘤分期較好(

轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者需要檢測(cè)RAS基因，來(lái)決定后續(xù)的治療方案，而以往的研究出現(xiàn)血液中與組織中檢測(cè)基因突變情況存在不一致性，即組織檢測(cè)為KRAS野生型而外周血中檢測(cè)為突變型。體內(nèi)和體外試驗(yàn)的ctDNA分析表明，阻斷EGFR通路，KRAS和NRAS突變將快速出現(xiàn)，通常在影像學(xué)證實(shí)腫瘤復(fù)發(fā)之前，就能夠檢測(cè)到突變的發(fā)生。而觀察應(yīng)用西妥昔單抗或帕尼單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者ctDNA發(fā)現(xiàn)，阻斷EGFR通路，將導(dǎo)致KRAS突變克隆的產(chǎn)生，而停藥后克隆逐漸減少，一段時(shí)間后，腫瘤細(xì)胞能夠再次恢復(fù)藥物敏感性，這表明克隆進(jìn)化持續(xù)存在，而ctDNA能夠動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)KRAS突變水平，為重新應(yīng)用抗EGFR類藥物提供依據(jù)[1]。另外，KRAS野生型及突變型的細(xì)胞系外泌體miRNA表達(dá)譜不同，miR-10b在野生型中選擇性上調(diào)，而miR-100在突變型中上調(diào)，這也提示外泌體miRNA作用于受體細(xì)胞，未來(lái)可能會(huì)成為預(yù)測(cè)KRAS突變的新模式，指導(dǎo)患者的治療方向[30]。

3 小結(jié)與展望

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代的來(lái)臨，液體活檢作為近年來(lái)新興起的分子診斷技術(shù)，在臨床診療工作中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，為臨床實(shí)踐帶來(lái)機(jī)遇。它的優(yōu)勢(shì)在于可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)克隆進(jìn)化、腫瘤負(fù)荷、指導(dǎo)靶向治療，在腫瘤個(gè)體化治療方面具有實(shí)用性。但是，目前液體活檢處于研究階段，仍然面臨很多挑戰(zhàn)，尚需要規(guī)范化技術(shù)及大規(guī)模前瞻性臨床試驗(yàn)來(lái)證明。相信在不遠(yuǎn)的未來(lái)，液體活檢可以更加精確全面的提供腫瘤基因組學(xué)信息，為患者帶來(lái)希望的曙光。