俞騰飛，裴允彤，張

（北京化工大學化工資源有效利用國家重點實驗室，北京 100029）

0 引言

原花青素（Proanthocyanidins，PC） 是植物中廣泛存在的一大類多酚類化合物的總稱，多存在于葡萄、山楂、花生、銀杏、松樹等植物的果實、籽和皮中，具有良好的抗氧化性和清除自由基能力[1-3]，是目前國際上公認的清除人體內自由基最有效的天然抗氧化劑。原花青素在人體內能被快速吸收，口服20 min內就能在人體血液中達到最高濃度，其在人體內抗自由基氧化能力可以達到等量VC的20倍和等量VE的50倍，能及時有效地清除血液中的自由基。正因為原花青素的這種強抗氧化能力，使其廣泛用于治療臨床上的水腫、糖尿病性視網膜病、靜脈曲張和過敏發(fā)炎等疾病。除此之外，原花青素還具有恢復人體膠原蛋白活力的能力，因此可用于生產口服營養(yǎng)品和化妝品，使皮膚平滑而富有彈性，達到保健的功效。原花青素還能保護人體免受陽光傷害，促進牛皮癬和壽斑的愈合，因此原花青素也是某些皮膚霜的極好添加劑。

目前，國內外提取原花青素的主要方法有溶劑萃取法、超聲波輔助萃取法、微波輔助萃取法、酶解法和超臨界流體萃取法等。其中，酶解法[4]能夠使植物組織分解，加速有效物質的溶出，從而提高提取率，但酶解時間一般略長，不利于工業(yè)化生產；超聲波輔助萃取[5]是一種物理破碎過程，超聲波的空化作用及其所產生的熱效應、乳化、擴散、擊碎等次級效應，有利于細胞內有效物質的釋放、擴散及溶解，并且具有無污染、操作簡單、提取快速、提取效率高等優(yōu)點，在植物萃取中具有良好的應用前景。目前，已有不少關于酶解法與超聲波法提取植物中有效成分的研究[6-7]，但是二者同時應用于葡萄籽中原花青素的提取研究還鮮有報道。試驗將纖維素酶及超聲波共同作用于葡萄籽原花青素的提取中，通過單因素試驗和正交試驗確定最佳提取條件，以期最大限度地提高原花青素的提取率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤露珠葡萄籽、原花青素標準品（阿拉丁試劑，純度≥95%），上海伊卡生物技術有限公司提供；纖維素酶（酶活性：15 000 U/g），北京格林博遠生物科技有限公司提供；甲醇、乙醇、石油醚（60～90℃）、香草醛、濃鹽酸、醋酸、醋酸鈉等，均為國藥分析純。

LE204E/02型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產品；JA5003型電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司產品；T6型新世紀紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產品；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式多用真空泵，河南省予華儀器有限公司產品；RE-52A型旋轉蒸發(fā)器，北京神泰偉業(yè)儀器設備有限公司產品；KQ3200DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品；HY-2A型數顯調速多用振蕩器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限責任公司產品；HH-2型數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限責任公司產品；TG16-WS型臺式高速離心機，長沙市維爾康湘鷹離心機有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 原花青素標準曲線的繪制

精確稱取原花青素標準品0.100 8 g置于燒杯中，加入少量蒸餾水溶解后緩緩倒入100 mL容量瓶中（燒杯多次洗滌后的液體均倒入容量瓶內），加蒸餾水至容量瓶100 mL刻度，搖勻。用移液槍分別精確吸取2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水至容量瓶25 mL刻度，搖勻。吸取上述各種濃度的樣品液0.5 mL于20 mL試管中，以蒸餾水作為空白對照，加入香草醛-甲醇溶液（0.04 g/mL）3 mL，再加入1.5 mL濃鹽酸，搖勻后放入30℃水浴中反應30 min[8]。將上述液體加入到比色皿中，以空白對照為基準，在550 nm處測其吸光度，以原花青素質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

原花青素標準曲線見圖1。

圖1 原花青素標準曲線

吸光度A=1.043 1C-0.002 3.

式中：C——原花青素質量濃度，mg/mL；

A——吸光度。

1.2.2 原花青素提取率的測定

將得到的葡萄籽原花青素提取液稀釋一定倍數后，按照1.2.1測定標準曲線的方法在550 nm處測定其吸光度，根據標準曲線回歸方程計算得到稀釋液中原花青素質量濃度，然后乘以稀釋倍數即可得到提取液中原花青素質量濃度，從而得出提取率。

式中：C——提取液中原花青素質量濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

m——脫脂葡萄籽質量，mg。

1.2.3 原料預處理

將葡萄籽洗凈后，放入一定溫度的烘箱內充分干燥，用粉碎機粉碎干燥后的葡萄籽，過40目篩，按葡萄籽質量與石油醚浸泡液體積1∶5的比例浸泡葡萄籽24 h（葡萄籽脫脂），過濾、干燥后得到備用的脫脂葡萄籽。

1.2.4 單因素試驗

（1）纖維素酶添加量對原花青素提取率的影響。準確稱取5份干燥的脫脂葡萄籽1.000 g置于100 mL具塞三角瓶內，各加入30 mL 60%的乙醇溶液，加入緩沖溶液調節(jié)pH值至5.0，纖維素酶的添加量分別為6，8，10，12，14 mg/g，放入超聲波儀內超聲20 min。待超聲完成后，提取液經離心、過濾后移至100 mL容量瓶內，并向容量瓶加去離子水至100 mL刻度線，測定原花青素的含量，從而確定纖維素酶的最適添加量。

（2）提取劑體積分數對原花青素提取率的影響。乙醇體積分數分別為40%，50%，60%，70%，80%，纖維素酶添加量10 mg/g，其余條件同（1），測定原花青素的含量，考查不同體積分數的乙醇溶液對原花青素提取率的影響。

（3）料液比對原花青素提取率的影響。分別加入60%的乙醇溶液20，25，30，35，40 mL，纖維素酶添加量10 mg/g，其余條件同（1），測定原花青素的含量，考查不同料液比對原花青素提取率的影響。

（4）超聲時間對原花青素提取率的影響。超聲時間分別為10，15，20，25，30 min，纖維素酶添加量10 mg/g，其余條件同（1），測定原花青素的含量，考查超聲時間對原花青素提取率的影響。

1.2.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，對纖維素酶添加量、乙醇體積分數、料液比、超聲時間4個因素分別取3個水平，按照L9（34）正交表進行優(yōu)化組合試驗。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

2 結果與分析

2.1 纖維素酶添加量對原花青素提取率的影響

纖維素酶添加量對原花青素提取率的影響見圖2。

圖2 纖維素酶添加量對原花青素提取率的影響

纖維素酶能夠促使葡萄籽中的纖維素水解，使植物細胞壁部分破損，細胞膜就會因此發(fā)生一定程度的變形或破裂，從而增加膜的滲透性，降低傳質阻力，促使原花青素更快地溶出[9-10]。由圖2可知，纖維素酶添加量在10 mg/g以下時，原花青素提取率隨纖維素酶添加量的增加而上升，在10 mg/g時達到最大值，超過此值后原花青素提取率反而下降。這是因為在纖維素酶添加量較低時，酶解反應尚未進行完全，隨著酶添加量的增加，反應趨于完全，繼續(xù)增加酶添加量，底物濃度不能對酶達到飽和，導致酶的作用受到抑制[11]。因此，選擇纖維素酶添加量10 mg/g左右較為合適。

2.2 乙醇體積分數對原花青素提取率的影響

乙醇體積分數對原花青素提取率的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分數對原花青素提取率的影響

由圖3可知，隨著乙醇體積分數的增加，原花青素提取率增大；當乙醇體積分數達到50%時，提取率達到最高。此后，再增加乙醇體積分數，原花青素提取率反而降低。這是由于乙醇體積分數較高時，一些醇溶性雜質、親脂性強的成分浸出量增加，這些成分會與乙醇、水分子結合，與原花青素的溶解形成競爭，從而導致原花青素的提取率下降[12]。因此，選擇乙醇體積分數為50%左右。

2.3 料液比對原花青素提取率的影響

料液比對提取率的影響見圖4。

圖4 料液比對原花青素提取率的影響

由圖4可知，在初始階段，原花青素的提取率隨料液比的增加而增大，在1∶35（g∶mL） 時達到最大值。繼續(xù)增加料液比，原花青素提取率稍有下降。這是由于過量的溶劑一方面會稀釋酶的濃度，從而減小酶與底物的接觸幾率；同時也會導致其他雜質的溶出，從而降低了原花青素的提取率。

2.4 超聲時間對原花青素提取率的影響

超聲時間對原花青素提取率的影響見圖5。

圖5 超聲時間對原花青素提取率的影響

由圖5可知，在10～30 min的超聲時間內原花青素提取率呈現先增加后下降的趨勢，在15～25 min時間內提取率幾乎不變。出現這種結果的原因，可能和纖維素酶與超聲波的協(xié)同作用有關。在較短的時間內，隨著超聲時間的增加，原花青素的溶出量增加，提取率增大；在15～25 min過程中，原花青素提取率維持在一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)；超過25 min后，由于體系中的溫度過高，使得纖維素酶逐漸失活，同時原花青素的結構也發(fā)生變化，提取率開始下降?？紤]到能耗成本，因此超聲時間選擇15 min左右為宜。

2.5 酶解溫度對原花青素提取率的影響

有關研究數據表明[9]，在一定范圍內，酶解溫度對原花青素提取率無明顯影響，因此試驗中沒有專門研究酶解溫度對原花青素提取率的影響。

2.6 正交試驗結果與分析

L9（34）正交試驗結果見表2，正交試驗方差分析見表3。

表2 L9（34）正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析

由表2可知，4個因素對葡萄籽原花青素提取效果影響的主次順序為A＞C＞B＞D。最佳工藝條件為A1B3C3D2，即纖維素酶添加量8 mg/g，乙醇體積分數55%，料液比1∶40（g∶mL），超聲時間20 min。

由表3可知，4個因素中纖維素酶添加量對提取率有比較顯著的影響，乙醇體積分數、料液比和超聲時間對提取率無顯著影響。

2.7 驗證試驗及討論

按照正交試驗得到的最佳提取條件：纖維素酶添加量8 mg/g，乙醇體積分數55%，料液比1∶40（g∶mL），超聲時間20 min進行試驗，脫脂葡萄籽原花青素的提取率為17.2%。同等條件下，不添加纖維素酶，單獨超聲時原花青素的提取率僅為14.6%。以上數據表明，纖維素酶協(xié)同超聲波輔助法對葡萄籽原花青素的提取率有一定的提高作用。

據文獻報道[10-15]，超聲波對纖維素的活性有促進作用，分析產生這種結果的原因可能包括以下幾個方面：①超聲波能產生強烈的空化及振蕩作用，增大了酶與底物的接觸頻率，同時纖維素酶可破壞植物細胞壁而降低超聲過程中的傳質阻力[16]，二者協(xié)同作用加快有效物質的溶出，提高原花青素提取率；②當超聲時間在一定范圍內，超聲波作用于纖維素酶時，不但不會降低酶的活性，還能產生能量促進酶介導反應的發(fā)生，增強了纖維素酶的活性[17-18]；③超聲過程中產生的熱效應提高了反應體系的溫度，加快分子運動速率，從而促進酶解反應的進行[19]。

3 結論

對脫脂葡萄籽進行了纖維素酶協(xié)同超聲波輔助法提取的研究，在單因素試驗的基礎上，設計正交試驗確定了最佳提取條件為纖維素酶添加量8 mg/g，乙醇體積分數55%，料液比1∶40（g∶mL），超聲時間20 min，測得原花青素的提取率為17.2%，單獨使用超聲波法用于脫脂葡萄籽原花青素提取時，原花青素提取率為14.6%，該法比單純的超聲波法提高了17.8%。纖維素酶協(xié)同超聲波輔助法結合了酶提取法與超聲波提取法的優(yōu)點，利用二者的相互促進作用顯著提高了葡萄籽原花青素提取率，具有提取時間短、條件溫和、提取率高等優(yōu)點，為植物中有效成分的提取提供了新途徑。

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