劉 波劉曦子 蘇祿暉朱麗紅楊 意

（1.上海市醫(yī)藥學(xué)校，上海 200135；2.南京大學(xué)金陵學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210037；3.上海市浦東新區(qū)公路管理署，上海 200129）

喜樹 （Camptotheca acuminata） 為珙桐科（Nyssaceae）喜樹屬（Camptotheca Decne.）植物，我國特有高大落葉喬木，主要分布于我國長江流域、西南各省區(qū)及印度部分地區(qū)，屬國家二級保護(hù)樹種[1-2]。喜樹根、莖、葉、果實(shí)及種子中提取的喜樹堿（Camptothecin，CPT）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種拓?fù)洚悩?gòu)酶I（Topoisomerase I）的抑制劑，具有廣譜抗癌活性，可用于胃癌、直腸癌、慢性粒細(xì)胞性白血病和急性淋巴性白血病的治療[3-6]。

近幾年來，各國學(xué)者對喜樹堿的生物活性成分進(jìn)行了廣泛的研究[7-16]，喜樹已成為世界性熱門研究課題。已有文獻(xiàn)報(bào)道了不同種源喜樹中CPT含量、不同省區(qū)喜樹葉中CPT含量、喜樹各器官中CPT含量、喜樹不同發(fā)育階段葉片中CPT含量以及不同生長季節(jié)嫩葉和成熟葉中喜樹堿的動態(tài)變化[13，17-22]，且喜樹各組織器官中，嫩葉中CPT含量可以達(dá)到植株地上部分平均含量的4倍[23-24]，但對于1年生喜樹生長發(fā)育以及不同葉齡喜樹葉片中CPT含量研究較少。本文采用HPLC色譜法對喜樹嫩葉和成熟葉中CPT的含量以及不同葉齡葉片中CPT含量進(jìn)行研究，同時(shí)對當(dāng)年生喜樹生長規(guī)律進(jìn)行研究探討，以期為藥用喜樹種植栽培，科學(xué)合理地開發(fā)喜樹資源，以及喜樹和喜樹堿產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，提高資源利用率和生產(chǎn)率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為1年生喜樹，種源為四川都江堰，種植地為上海市浦東新區(qū)劃某綠化養(yǎng)護(hù)公司苗圃。以整個(gè)植株、植株新梢上的嫩葉（枝頂1～3位葉）和成熟葉作（枝條中下部葉，葉片深綠色）為試驗(yàn)材料。

2016年4～11月份，分別于每月中旬及月底采集喜樹嫩葉與成熟葉，采集時(shí)間均為早上9∶00。不同葉齡葉片喜樹堿含量測定，每5天采集1次喜樹葉片，采集時(shí)間均為早上9∶00。

所有采集后的樣品均用清水洗凈，60℃烘干，恒重，粉碎至60目，干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

Jasco高效液相色譜儀、975型紫外檢測器、TG328A型電子天平、Heraeus Biofuge 22R型高速冷凍離心機(jī)、Buchi R210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、索氏提取器。

乙腈（色譜純）、無水乙醇（分析純）、95%乙醇和重蒸餾水。

1.3 色譜條件

色譜Waters ODS柱（25 cm×4.6 mm）；流動相：乙腈 - 水（V/V=4∶6）；流速：1 mL/min；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：25 ℃。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

精密稱取喜樹堿對照品3.5 mg，置于100 mL容量瓶中，以乙腈-水（4∶6）為溶劑，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻、定容，備用。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取喜樹堿1.0、2.0、3.0……9.0 mL于10 mL容量瓶中，用相同溶劑定容至刻度，搖勻。按照上述色譜條件，分別取稀釋后樣品及原標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，取峰面積的平均值。得峰面積（Y）與喜樹堿濃度（X）的線性回歸方程：Y=1 807.49X-1 343，R2=0.999 5。

1.6 喜樹堿提取

精密稱取干燥喜樹葉粉3.000 g，用30 mL 95%乙醇，索氏提取8 h，提取3次，合并提取液。用移液管精密吸取提取液200 μL，移入2 mL離心管中，用95%乙醇稀釋6倍，12 000 r/min條件下離心5 min，精密吸取上清液，直接進(jìn)樣，計(jì)算喜樹堿提取率。

1.7 喜樹生長測定

2016年4～11月，于每月中旬、月底選擇10株喜樹幼樹，分別用卷尺和游標(biāo)卡尺測定株高、基徑。測定時(shí)間均為早上9：00。

喜樹生物量測定：用TG328A型電子天平精確稱定樹根、莖、葉，105℃左右烘干6 h，取出，精密稱重至恒重。

2 結(jié)果與分析

2.1 喜樹高生長動態(tài)變化

由圖1可以看出，1年生喜樹高生長呈現(xiàn)慢-快-慢的“S”型變化趨勢，即4～5月份高生長速率較慢，6月份高生長速率迅速增大，6月中旬～7月中旬高生長最快，生長速率最大值出現(xiàn)在7月中旬，此時(shí)苗高為46.39 cm，生長速率為0.816 0 cm/d，后喜樹生長速率逐漸降低，10月中旬后喜樹高生長迅速減慢，11月末喜樹高生長趨向停止。

圖1 1年生喜樹樹高動態(tài)變化

2.2 喜樹粗生長（基徑）動態(tài)變化

由圖2可以看出，1年生喜樹粗生長亦呈現(xiàn)慢-快-慢的“S”型變化趨勢，即4～5月份高生長速率較慢，6月份高生長速率迅速增大，6月中旬～7月中旬高生長最快，生長速率最大值出現(xiàn)在7月中旬，此時(shí)，苗基徑為5.55 mm，生長速率為0.121 7 mm/d，后喜樹粗生長速率逐漸降低，10月中旬后喜樹粗生長迅速減弱，11月末喜樹基徑粗生長趨向停止。

圖2 1年生喜樹基徑動態(tài)變化

2.3 喜樹總生物量動態(tài)變化

由圖3可以看出，1年生喜樹總生物量也呈現(xiàn)慢-快-慢的“S”型變化趨勢，即4～5月份總生物量增長速率較慢，6月份增長速率迅速增大，6月中旬～7月中旬生物量增長最快。

圖3 1年生喜樹生物量動態(tài)變化

總生物最大值出現(xiàn)在7月中旬，此時(shí)總生物量為2.796 5 g/株，增長速率為0.070 3 g/d·株，后喜樹總生物量增長速率逐漸降低，10月中旬后喜樹總生物量增長迅速下降，11月末喜樹基徑粗生長趨向停止。

2.4 喜樹葉片中喜樹堿含量的季節(jié)性變化

由圖4可以看出，在喜樹1年生長過程中，嫩葉和成熟葉中喜樹堿含量均為單峰曲線。從4～7月份，嫩葉與成熟葉中喜樹堿含量均呈上升趨勢，其中嫩葉在7月中旬含量達(dá)到最大值，為0.912 9‰，成熟葉中喜樹堿含量亦在7月中旬達(dá)到最大值，為0.591 68‰。后嫩葉與成熟葉中喜樹堿含量均呈降低趨勢，嫩葉與成熟葉中喜樹堿含量均在11月份最低，分別為0.141 8‰和0.079 1‰。比較顯示，嫩葉與成熟葉中喜樹堿含量均在6月下旬、7月中旬含量最高，與其他月份相比差異顯著（P＜0.05）。主要原因是這個(gè)時(shí)期，光照、溫度、水分及其他生理生態(tài)因子均適宜喜樹生長，植物體內(nèi)各生理代謝活動旺盛，合成的次生代謝產(chǎn)物喜樹堿的速率較快。此后CPT含量持續(xù)降低，至11月下旬，嫩葉與成熟葉中CPT含量明顯降低，并且較當(dāng)年4月中旬的含量低，而此時(shí)，喜樹體內(nèi)各生理代謝活動亦相對穩(wěn)定并逐漸減弱。在整個(gè)生長期內(nèi)，嫩葉中CPT含量均高于同期成熟葉中的CPT含量，差異極顯著（P＜0.01）。喜樹葉片中喜樹堿含量與喜樹1年中的生長和生理活動過程相關(guān)。

圖4 不同月份喜樹葉片中喜樹堿含量變化

2.5 喜樹不同葉齡葉片中喜樹堿含量變化

由圖5可以看出，葉片中CPT含量與葉齡（展開天數(shù)）呈負(fù)相關(guān)，葉齡愈小，喜樹堿含量愈高，葉齡愈大，CPT含量愈低。葉齡5天時(shí)，CPT含量出現(xiàn)最大值，為2.098 2‰，葉齡為10天的喜樹葉，CPT含量為1.983 9‰，后隨著葉片葉齡逐漸增大，CPT含量卻出現(xiàn)急劇降低的變化趨勢，當(dāng)葉齡為70天時(shí)，CPT含量最低，為0.092 3‰。

圖5 CPT含量-葉齡動態(tài)變化

3 結(jié)論與討論

劉麗杰等[13]對處于不同發(fā)育階段的當(dāng)年生喜樹葉中CPT含量變化的研究發(fā)現(xiàn)，其成熟葉CPT含量在6月份達(dá)到最高值，此后逐漸減少，在8～9月份之間CPT含量略有增加。Liu等[26]研究結(jié)果顯示，喜樹葉片中CPT含量從4月至10月平均每月下降11%；張玉紅等[27]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，喜樹嫩葉中CPT含量為一單峰曲線，在7月份達(dá)到最高值。郭勇[28]等研究顯示，喜樹是嫩葉還是成熟葉，在生長期內(nèi)，其CPT含量變化均為雙峰曲線，分別在6月和9月達(dá)到峰值，其中以6月份CPT含量最高。張顯強(qiáng)等[15]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，喜樹葉片中的CPT含量4～5月份逐漸上升，6～11月，CPT含量均不高，且不斷下降。本研究喜樹生長期內(nèi)，無論是嫩葉還是成熟葉，CPT含量變化均為單峰曲線，且CPT含量變化與喜樹生理變化過程一致，這一研究結(jié)果與張玉紅[27]的研究結(jié)論相同，對于不同葉齡喜樹葉中喜樹堿含量，葉齡為5天的喜樹葉中含量最高，后逐漸降低，這與郭勇[28]的研究結(jié)論相同。研究表明，輕度遮蔭，喜樹葉片喜樹堿含量較全光照的有所提高[29-30]，適當(dāng)?shù)土酌{迫可以增加幼苗及葉片中喜樹堿含量[31]，不同土質(zhì)可影響喜樹幼苗生長及葉片中的喜樹堿含量，花土栽培較適合喜樹幼苗的生長和葉片中喜樹堿產(chǎn)量的提高[31]。

［1］ 曹淑燕，李映珍.喜樹生物學(xué)特性與栽培技術(shù)［J］.廣州林業(yè)科技，2000，23（1）：118-120.

［2］ 中國科學(xué)院中國植物編輯委員會.中國植物志［M］.北京：科學(xué)出版社，1983．

［3］ Wall ME，Wani MC，Cook CE，Palmer KH，McPhail AT，Sim G A．Plant antitumor agents.I．The isolation and structure of camptothecin，a novel alkaloidal leukemia and tumor inhibitor fromCamptotheca acuminata［J］.J Amer.Chem.Soc.，1966，88（16）：3 888-3 890．

［4］ Hisang Y H，Herizberg R，Hecht S，Liu L F．Camptothecin inducesprotein-linkedDNA BreaksviamammalianDNA topoisomerase I［J］．J bioal Chen，1985（27）：4 873-4 878．

［5］ Hisang Y，Liu L F．Identification of Mammalian DNA topoisomerase I as an intracellular target of the anticancer drug camptothecin［J］．Cancer Research，1998（48）：1 772-1 726．

［6］ FortuneJM，VeleaL，GravesDE，UtuugiT，YamadaY，Osheroff N.DNA Tipoisomerases as targets for the anticancer drug TAS-103:DNA interactions and topoisomerase catalytic inhibition［J］.Biochemistry，1999，19（30）：15 580-15 586．

［7］ 趙潔.光質(zhì)和溫度與2，4-D組合對喜樹葉片脫分化的效應(yīng)［J］．華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1992，26（4）：482-486.

［8］ Liu A，Adams J C，Viator H P，et al.Influence ofsoil fertilization，plant spacing，and coppicing on growth，stomatal conductance，abscisic acid，and camptothecin levels in Camptotheca acuminata［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，24（6）：1 118-1 122．

［9］ 劉文哲，秦海燕，索志榮.喜樹果中喜樹堿和10－羥基喜樹堿的HPLC分析［J］.藥物分析雜志，2005，25（2）：168－170.

［10］ 孫世芹，閻秀峰.喜樹幼苗中喜樹堿及其代謝相關(guān)酶的分布［J］, 中草藥，2008，39（8）：1 231-1 234．

［11］ 王立屏，魏永巨.熒光分析法測定喜樹果藥材中的喜樹堿［J］. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012,47（10）：1 370-1 374．

［12］ 周濤，江維克，梅旋，等.貴州喜樹的分布特征及群落結(jié)構(gòu)［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010,38（10）：157-159．

［13］ 劉麗杰，于景華.當(dāng)年生喜樹不同發(fā)育階段葉中喜樹堿和10-羥基喜樹堿含量變化［J］.齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào)，2009（4）：63-67．

［14］ 史偉國，祖元?jiǎng)?，楊磊，?聚酰胺分離純化喜樹果中10-羥基喜樹堿和喜果苷的研究［J］.中國中藥雜志，2008，33（21）：2 486-2 489．

［15］ 張顯強(qiáng)，乙引，洪鯤，等.喜樹各器官喜樹堿（CPT）含量變化分析［J］.湖貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，22（4）：12-14．

［16］ 郭群，萬軍梅.液相色普質(zhì)譜聯(lián)用法分析喜樹果中苷類化學(xué)成分［J］. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012，8（1）：26-28．

［17］ 張玉紅，祖元?jiǎng)?不同產(chǎn)地和生長季節(jié)喜樹葉中喜樹堿（CPT）含量測定［J］.植物學(xué)通報(bào)，2003，20（5）：572-575.

［18］ 張玉紅.液喜樹果實(shí)中喜樹堿含量的產(chǎn)地差異及季節(jié)變化［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，30（6）：44-46．

［19］ 黃瑞松，葉云峰，梁啟成，等.HPLC法測定不同產(chǎn)地喜樹果中喜樹堿［J］.中草藥，2009，40（1）：137-140．

［20］ 王玲麗，劉文哲.不同種源喜樹幼枝中喜樹堿的含量［J］.植物學(xué)通報(bào)，2005，22（5）：584-589．

［21］ 劉毅，蘇付保，粟本超，等.13個(gè)廣西喜樹種源的喜樹堿含量分析［J］. 廣西林業(yè)科學(xué)，2017，46（1）：119-121．

［22］ 鄧仕明，王發(fā)松，周大寨，等.喜樹不同部位喜樹堿的質(zhì)量分析比較研究［J］.湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，27（3）：258-260．

［23］ 王洋，于濤，祖元?jiǎng)?，?從喜樹葉中堿法提取喜樹堿新工藝［J］. 中草藥，2001，32（10）：882-884．

［24］ Liu Z，Carpenter S B，Bourgeois W J，et al．Variations in the secondary metabolite camptothecin in relation of tissue age and season in Camptotheca acuminata ［J］.Tree Physiology，1998（18）：265-270．

［25］ 向極釬，江喜敏，李紅英，等.二年生喜樹各器官中喜樹堿含量動態(tài)分析［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（12）：3141-3 143.

［26］ 張玉紅，祖元?jiǎng)?不同產(chǎn)地和生長季節(jié)喜樹葉中喜樹堿含量測定［J］. 植物學(xué)通報(bào)，2003，20（5）：572-575．

［27］ 郭勇，林桂蕓，孫雁霞，等.喜樹葉片中喜樹堿含量的季節(jié)變化研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，19（1）：143-145.

［28］ 王博文，王洋，閻秀峰.光強(qiáng)對喜樹幼苗喜樹堿含量及分配的影響［J］.黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23（2）：260-264．

［29］ 王洋，戴紹軍，閻秀峰.光強(qiáng)對喜樹幼苗葉片次生代謝產(chǎn)物喜樹堿的影響［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，24（6）：1118-1122.

［30］ 楊朗生，蒲擎宇，蹇凱.不同施磷水平對喜樹幼苗生長及喜樹堿積累的影響［J］.四川林業(yè)科技，2015，36（2）：98-101，14.

［31］ 馬偉，戴紹軍，趙昕，等.不同土質(zhì)對喜樹幼苗生長和喜樹堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)及產(chǎn)量的影響［J］.四川林業(yè)科技，2015，36（2）：98-101，14．