張穎

2016年11月山東省某豬場發(fā)生了一種以出血性敗血癥、心包積液為主要特征的傳染病。該病發(fā)病突然，病程急，發(fā)病豬出現(xiàn)體溫升高、精神沉郁、呼吸困難、結(jié)膜發(fā)紺，口鼻有泡沫狀液體流出及病豬倒地不起等癥狀，發(fā)病急，來不及用藥就出現(xiàn)死亡，給發(fā)病的豬場造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。采集死亡病豬肝脾及心包積液等病料經(jīng)實驗室進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色、生化特性鑒定、玻片凝聚試驗、藥敏試驗及動物回歸試驗，并經(jīng)PCR檢測確定為豬鏈球菌感染?，F(xiàn)報告如下：

1材料與方法

1.1主要試驗材料

病料為從山東省幾個豬場采集的疑似豬鏈球菌感染的病豬病料，體重為18～20g的健康小鼠購自河南大學(xué)實驗動物中心。

1.2主要試劑

TaqDNA聚合酶、dNTPs及DNA Marker DL2000等購自大連寶生物工程有限公司；膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。改良馬丁肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉等試劑購自北京索萊寶科技有限公司；豬鏈球菌的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、藥敏紙片購自北京天壇生物公司；細(xì)菌生化反應(yīng)管購自杭州天和微生物試劑有限公司；其他化學(xué)試劑如氯仿、異丙醇和乙醇等，均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3細(xì)菌的分離培養(yǎng)

無菌取發(fā)病豬的肝臟及心包積液用接種環(huán)劃線接種于含5%綿羊血的馬丁肉湯瓊脂平板上，放置于37℃的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，觀察生長情況及菌落特征。挑取疑似菌落涂片并進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。觀察細(xì)菌形態(tài)及溶血情況。

1.4細(xì)菌的生化鑒定

將所分離細(xì)菌純化培養(yǎng)后接種于馬丁肉湯瓊脂平板上，放置于37℃的C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)36h，觀察是否有溶血現(xiàn)象。挑取生長良好的單菌落轉(zhuǎn)移接種于各個微量生化反應(yīng)管，根據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司說明書進(jìn)行，觀察生化反應(yīng)特性，鑒定結(jié)果。

1.5玻板凝集試驗

將分離鑒定的疑似豬鏈球菌的分離菌落接種改良馬丁肉湯培養(yǎng)基，37℃的C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，取1.0mL培養(yǎng)菌液，4，000r/min離心5min，棄上清，用適量PBS懸浮沉淀，取20μL懸浮菌液與等體積的無菌PBS、豬鏈球菌2型陽性血清進(jìn)行玻片凝集試驗，同時設(shè)PBS空白對照進(jìn)行陰性對照。

1.6藥敏試驗

無菌條件下對分離細(xì)菌培養(yǎng)物利用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗，將分離的豬鏈球菌接種在改良馬丁肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后無菌挑取單菌落后均勻涂布普通瓊脂平板，用滅菌鑷子夾取青霉素、阿莫西林和紅霉素等各種藥敏紙片貼在適當(dāng)?shù)奈恢茫瑢⑴囵B(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)24h觀察測定抑菌圈的大小，判斷對不同藥物敏感性。

1.7細(xì)菌的致病性動物回歸試驗

將純化的分離菌、增菌接種到改良馬丁肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～24 h制成細(xì)菌懸液，接種8只健康的健康小白鼠，隨機(jī)分成2組，每組4只，第1組小鼠腹腔注射0.5mL/只，第2組腹腔注射馬丁肉湯培養(yǎng)基作為對照組。觀察實驗小鼠的發(fā)病情況，剖檢死亡小鼠觀察病理變化，取病料鏡檢。

1.8細(xì)菌的PCR鑒定

從GenBank中豬鏈球菌序列，參照文獻(xiàn)中16srRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1，150bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌的分離培養(yǎng)

取病變肝臟研磨后接種培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)36h后，觀察菌落特征，其表面光滑濕潤，邊緣有整齊的乳白色圓形小菌落，且有顯著溶血環(huán)。革蘭染色鏡檢可見呈鏈狀排列的革蘭氏陽性球菌。

2.2細(xì)菌的生化鑒定

本實驗生化試驗結(jié)果表明：分離的鏈球菌糖發(fā)酵特性活潑，能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖和蔗糖等，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；且該分離菌不能發(fā)酵木糖、半乳糖、甘露和山梨醇等；氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗為陰性，甲基紅試驗、亞甲藍(lán)還原試驗結(jié)果呈陽性。

2.3玻板凝集試驗結(jié)果

分離的鏈球菌與購買的豬鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清玻板凝集試驗結(jié)果為陽性，陰性對照無凝集。

2.4藥敏試驗結(jié)果

試驗結(jié)果：該分離株鏈球菌對不同抗生素藥物的敏感程度不同，該菌株對氨芐西林、青霉素、諾氟沙星和頭孢噻肟高敏；對環(huán)丙沙星、氧氟沙星和慶大霉素中敏；而對林可霉素和鏈霉素不敏感，具有耐藥性。

2.5細(xì)菌的致病性動物回歸試驗

將分離的鏈球菌腹腔接種健康小鼠后，第1組小鼠出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，均在24～72h內(nèi)死亡，對照組小鼠無明顯臨床癥狀。剖檢死亡小鼠出現(xiàn)出血性敗血癥、心包積液等特征，頜下及腹股溝淋巴結(jié)腫大。取其心包積液涂片染色鏡檢為革蘭氏陽性球菌。2.6分離菌的PCR鑒定

提取分離菌株的DNA為模板，以不加模板為陰性對照，通過特異性的16srRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳可見1，150bp左右的特異條帶，與預(yù)期目的條帶位置一致，陰性對照未見條（圖1）。

3討論

近年來，隨著世界養(yǎng)豬業(yè)集約化發(fā)展，豬鏈球菌病呈上升趨勢，已成為嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的典型細(xì)菌性疾病，給我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時該病作為人畜共患傳染病還給公共衛(wèi)生安全帶來了嚴(yán)重威脅。根據(jù)臨床癥狀、典型病理變化以及病原菌的分離鑒定可以進(jìn)行副豬嗜血桿菌感染的診斷。本試驗中分離的病原菌從培養(yǎng)特性、染色鏡檢、溶血特性及生化特性等都符合豬鏈球菌的生物學(xué)特性。將分離菌的培養(yǎng)產(chǎn)物接種小鼠，出現(xiàn)該病

典型癥狀，動物回歸試驗證實該菌具有較強(qiáng)的致病性，同時PCR檢測證實了該分離菌為豬鏈球菌。endprint