相欣然，萬曉梅，索紅波，胡燚

1 引言

碳納米管作為一種中空結(jié)構(gòu)的新型一維量子納米材料，獨特的結(jié)構(gòu)賦予其良好的導電傳熱性能、適宜的比表面積、特殊的孔道結(jié)構(gòu)、高穩(wěn)定性以及生物相容性等優(yōu)點，作為一種新型的酶固定化載體在酶工程領(lǐng)域得到了廣泛的關(guān)注1-4。然而，碳納米管的表面較為光滑，缺少活性基團，而且碳納米管之間具有極強的疏水作用，導致其在很多反應體系溶液溶解度低或分散不均勻，因此利用碳納米管固定化酶存在著固定化效率不高、分散能力較差、酶學性能不佳等缺陷5-7。針對此問題，對碳管表面進行化學修飾，引入功能有機分子，改變載體的表面結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，可有效的改善固定化酶的酶學性能8,9。

離子液體作為一種可設(shè)計的綠色溶劑在有機合成、電化學、材料科學、分離工程等領(lǐng)域得到了廣泛的應用，而且很多種類的酶在離子液體作為反應介質(zhì)或添加劑作用下顯示出了很好的活性、穩(wěn)定性和選擇性10-12。近年來，離子液體作為一種全新的酶固定化載體表面修飾劑獲得了成功應用。Jiang等13將褶皺假絲酵母脂肪酶(CRL)固定在咪唑類離子液體修飾的 Fe3O4-SiO2核殼結(jié)構(gòu)磁性納米粒子上，并考察了離子液體不同的陰離子對固定化酶酶學性能的影響；結(jié)果表明，當以 PF6-作為陰離子時，固定化酶的活性最高。本課題組在之前的研究工作中將功能性離子液體作為一種新型的修飾劑對介孔材料進行表面修飾改性，顯著地提高了豬胰脂肪酶(PPL)、洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶(BCL)等脂肪酶的活性、熱穩(wěn)定性和重復使用性等酶學性能14-18。

Candida antarctic lipase B (CALB)是一種多功能酶，廣泛應用于催化各種反應，如動力學拆分、氨解、酯化、酯交換及水解反應，此外，CALB還具有較強有機溶劑耐受性、熱穩(wěn)定性及對映體特異性等優(yōu)良特性。其對非水溶性和水溶性物質(zhì)都用很強的催化活性，可用于許多有機化合物，醫(yī)藥中間體等的合成19-21。MWNTs在酶固定化領(lǐng)域的應用中，采用具有不同陰離子的離子液體表面修飾 MWNTs之前并沒有相關(guān)報道，而離子液體本身屬性的不同會對固定化酶的酶學性能產(chǎn)生影響。通常陰離子對脂肪酶活力影響的差異性遠大于陽離子，為了進一步探討離子液體中陰離子變化對固定化脂肪酶的影響，本文在前期工作基礎(chǔ)上將具有不同陰離子的功能化離子液體用于多壁碳納米管(MWNTs)的表面共價修飾，改變其表面結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，研究修飾前后固定化CALB的酶學性能變化，拓展離子液體作為酶固定化載體修飾劑的應用領(lǐng)域，為相關(guān)領(lǐng)域的科研工作者提供一定的參考價值。

2 實驗部分

2.1 實驗試劑與儀器

試劑：褶皺假絲酵母脂肪酶 B (CALB，10 mg·mL-1，購于 Novozymes)；碳納米管(MWNTs，購于深圳納米港)；1-(3-氨基丙基)咪唑、氯化亞砜(SOCl2)、硝酸、硫酸、四氫呋喃(THF)、鹽酸(HCl)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、溴丁烷、四氟硼酸鈉、六氟磷酸鉀、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、考馬斯亮藍(G250)、牛血清蛋白、酚酞(指示劑)，所用試劑均為分析純。

儀器：電子天平(JY10001)，旋轉(zhuǎn)式恒溫水浴振蕩器(DSHZ-300A)，恒溫磁力攪拌器(DSHZ-300A)，集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S)，循環(huán)水式真空泵(SHZ-III)，pH 計(PHS-3C)，離心機(5804R)，真空冷凍干燥機(FD-1A-50)，透射電子顯微鏡(JEM-200CX，加速電壓200 kV)，熱重分析儀(TGA，STA 409 PC)，酶標儀(Model680)。

2.2 實驗方法

2.2.1 載體的制備

載體的制備方法如圖1所示22,23。具體為：取1 g MWNTs，分散在 2 L 2.6 mol·L-1的硝酸，70 °C攪拌加熱回流 48 h，離心(4500 r·min-1，10 min)，棄上清液去除無定形碳，用0.22 μm的聚四氟乙烯膜(PTFE)過濾，去離子水洗至中性，濾餅在80 °C真空干燥8 h。將純化的MWNTs分散在濃酸混合液 H2SO4：HNO3(3 : 1，v/v)中，40 °C 超聲 3 h，用0.22 μm PTFE膜過濾，去離子水洗至中性，濾餅 80 °C真空干燥 8 h，得羧基化 MWNTs(MWNTs-COOH)。取100 mg MWNTs-COOH分散在30 mL SOCl2中，氮氣保護下，回流攪拌反應24 h，過濾，用無水THF洗滌，室溫干燥2 h，得到酰氯官能化MWNTs (MWNTs-COCl)；氮氣保護下，將MWNTs-COCl與30 mL 1-(3-氨丙基)咪唑，120 °C反應 24 h，經(jīng) 0.22 μm PTFE 膜過濾，用無水 THF、1 mol·L-1HCl溶液、飽和 NaHCO3溶液洗滌，接著用去離子水洗至中性，最后用乙醇洗滌，60 °C真空干燥過夜，得中間產(chǎn)物A。氮氣保護下，將產(chǎn)物A與溴丁烷80 °C反應24 h，經(jīng)0.22 μm PTFE膜過濾，用無水THF洗滌，室溫真空干燥24 h，得到中間產(chǎn)物B。中間產(chǎn)物B在去離子水中與NaBF4，KPF6進行陰離子交換24 h，過濾，得到烷基功能化離子液體修飾的碳納米管，分別命名為MWNTs-IL(BF4-)、MWNTs-IL(PF6-)。而中間產(chǎn)物 B與 NaH2O4在二氯甲烷中進行陰離子交換24 h，過濾，得到以H2PO4-為陰離子的烷基化離子液體修飾的碳納米管，命名為 MWNTs-IL(H2PO4-)。

圖1 烷基化功能化離子液體修飾MWNTs的制備過程Fig.1 General procedure of synthesis of MWNTs-IL.

2.2.2 載體及的表征

本實驗采用德國NETZSCH公司的STA 409 PC型熱重分析儀(TGA)測定離子液體在碳納米管上的負載情況，加熱范圍為50-700 °C，升溫速率10 °C·min-1，在 20 mL·min-1氮氣流中進行。采用美國Thermo公司的ESCALAB250XI型X射線光電子能譜(XPS)分析離子液體在碳納米管上的負載情況，采用日本JEOL公司的JEM-200CX型透射電子顯微鏡(TEM)和法國Horiba公司的Labram HR800型激光共焦顯微拉曼光譜儀(Ramanspectra)分析載體的微觀形貌。

2.2.3 固定化酶的制備

取50 mL磷酸緩沖液(PBS，pH = 7.0，0.025 mol·L-1)于 100 mL 錐形瓶中，加入 0.1 g載體(MWNTs、MWNTs-IL(Br-)、MWNTs-IL(BF4-)、MWNTs-IL(PF6-)和 MWNTs-IL(H2PO4-)，超聲 10 min。將3 mL Lipozyme CALB加入錐形瓶中，加塞密封后置于 30 °C 水浴中，150 r·min-1下震蕩反應 7 h后，將混合液抽濾并用大量磷酸緩沖液(PBS，pH = 7.0，0.025 mol·L-1)洗滌數(shù)次，于凍干機中冷凍干燥 1 h，即得到固定化 CALB分別記為 MWNTs-CALB、MWNTs-IL(Br-)-CALB、MWNTs-IL(BF4-)-CALB、MWNTs-IL(PF6-)-CALB和MWNTs-IL(H2PO4-)-CALB。

2.2.4 固定化效率的測定

(1) 蛋白含量測定

按照 Bradford的方法24，以牛血清蛋白作為標準蛋白質(zhì)繪制標準曲線。

(2) 固定化效率測定

測定固定化后殘液的吸光值，根據(jù)上述得到的標準曲線來計算蛋白濃度。

Ci和Cf分別表示溶液中固定化前酶蛋白的初始濃度和固定化后酶蛋白的最終濃度(mg·mL-1)。

2.2.5 固定化酶酶活測定

(1) 三乙酸甘油酯乳化液的制備

在100 mL錐形瓶中加入60 mL磷酸緩沖液(PBS，pH = 7.0，0.025 mol·L-1)，2 g 三乙酸甘油酯，磁力攪拌器強力攪拌10 min使其成為乳化液。

(2) 酶活測定

在上述制備的三乙酸甘油酯乳化液中加入0.1 g固定化CALB，在60 °C，pH = 7.0條件下平穩(wěn)攪拌反應30 min后立即加入15 mL體積比為1 :1的丙酮-乙醇以終止反應。用 0.05 mol·L-1的NaOH溶液來滴定中和反應過程中產(chǎn)生的酸，其中指示劑為酚酞，記錄NaOH的消耗量。酶活定義為：在一定條件下，每分鐘催化三乙酸甘油酯生成1 μmol醋酸所需要的酶量。

比活力(U/g CALB) = 固定化CALB的表觀活力/每克固定化酶中VALB的含量(2)

2.2.6 最適溫度及最適pH

2.2.6.1 最適溫度

調(diào)節(jié)反應液 pH 值為 7.0，分別在 35 °C、40 °C、45 °C、50 °C、55 °C、60 °C、65 °C、70 °C 和 75 °C下磁力攪拌反應30 min，取出后對固定化酶的活力進行測定，以選擇最適宜的反應溫度。

2.2.6.2 最適pH

調(diào)節(jié)反應液pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和9.5，于60 °C下磁力攪拌反應30 min，取出后對固定化酶的活力進行測定，以選擇最適宜的pH。

2.2.7 固定化酶的穩(wěn)定性

2.2.7.1 熱穩(wěn)定性

將固定化酶置于60 °C水浴中分別保溫0、5、10、15和20 min后取出，測定各固定化酶酶活(將各自未保溫時所測得的酶活定義為 100%)，以考察固定化酶的溫度耐受性。

2.2.7.2 重復使用性

取0.1 g固定化酶于60 °C，pH 7.0的反應條件下反應30 min后，抽濾并用磷酸緩沖液洗滌，得到的固定化酶置于凍干機中冷凍干燥1 h，用于下一次反應；將得到的濾液用 0.05 mol·L-1的NaOH溶液進行滴定測定酶活(第一次使用時測定的酶活定義為100%)。

2.2.8 反應動力學參數(shù)的測定

配置濃度分別為 5、10、15、20、25和 30 mg·mL-1的三乙酸甘油酯乳化液，測定不同濃度乳化液濃度下反應30 min后各固定化酶的酶活，酶活測定方法同2.2.4。

2.2.9 圓二色性光譜檢測

分別取 MWNTs、MWNTs-IL(Br-)、MWNTs-IL(PF6-)、CALB、MWNTs-CALB、MWNTs-IL(Br-)-CALB、MWNTs-IL(PF6-)-CALB溶于磷酸緩沖液(pH 7.0)中，配成所需的濃度。以相應的載為空白，用圓二色譜儀(JASCO-J810)分別對樣品的進行定量檢測。石英樣品池的光程為1 cm，掃描測定波長范圍為180-300 nm，掃描速度為50 nm·min-1。每個樣品掃描十次取平均值。

3 結(jié)果與討論

3.1 載體的表征

3.1.1 透射電子顯微鏡

采用 JEM-2100(HR)型透射電鏡(TEM)上觀察載體的形貌和結(jié)構(gòu)，純化的 MWNTs、MWNTs-COOH、MWNTs-IL(Br-)、MWNTs-IL(BF4-)、MWNTs-IL(PF6-)及 MWNTs-IL(H2PO4-)的透射電鏡圖如圖 2所示，由圖可以看出，修飾過程并沒有破壞碳納米管的結(jié)構(gòu)完整性20。

3.1.2 拉曼光譜(RS)

MWNTs、MWNTs-COOH及MWNTs-IL(PF6)的拉曼光譜如圖 3所示，由圖可知，修飾前后的碳納米管均在幾個特征區(qū)存在吸收，且未發(fā)生明顯的位移，表明功能化的過程基本沒有破壞MWNTs本身的結(jié)構(gòu)。同時，通過R = ID/IG比值(其中I為特征峰的積分面積)來表征，其中R值越大表明碳納米管缺陷程度越大、有序度越低。通過對吸收峰的面積進行計算發(fā)現(xiàn)，相比于 MWNTs(R = 1.049)，MWNTs-COOH (R = 1.130)和 MWNTs-IL(PF6) (R = 1.227)的R值略有增大，該結(jié)果說明功能化后的碳納米管的缺陷程度略有增加，有序度略有下降23。該結(jié)果與電鏡結(jié)果一致，進一步證明了表面改性并沒有破壞多壁碳納米管的結(jié)構(gòu)完整性。

3.1.3 熱重分析

純化的MWNTs、MWNTs-IL(Br-)、MWNTs-IL(BF4-)、MWNTs-IL(PF6-)及 MWNTs-IL(H2PO4-)的TG曲線如圖4所示，從圖中可以看出，原始的MWNTs在600 °C以下比較穩(wěn)定，而離子液體修飾的 MWNTs表現(xiàn)出有各區(qū)域明顯的失重，第一區(qū)域的失重(-350 °C)可能是MWNTs表面接枝的咪唑鹽的分解，第二區(qū)域中的顯著失重(-580 °C)可能是由于 MWNTs自身的分解，表明離子液體已修飾到MWNTs的表面23,25。

3.1.4 X射線光電子能譜(XPS)

為了進一步確認離子液體成功負載在MWNTs上，利用XPS分析了咪唑環(huán)是否存在及離子交換是否進行，如圖5。從(a)圖中可以看出，MWNTs-IL (PF6)中N信號(402 eV)的存在說明了咪唑環(huán)已經(jīng)存在于MWNTs中；從圖(b, c)中可以看出，P信號(136.6 eV)、F信號(686.8 eV)的存在以及MWNTs-IL (PF6)中不存在Br-信號說明陰離子交換成功23,26。

3.2 固定化酶催化活性研究

圖2 MWNTs (a), MWNTs-COOH (b), MWNTs-IL(Br-) (c), MWNTs-IL(BF4-) (d), MWNTs-IL(PF6-) (e)及MWNTs-IL(H2PO4-) (f)的 TEM圖Fig.2 TEM images of the (a) pristine MWNTs, (b) MWNTs-COOH, (c) MWNTs-IL(Br-), (d) MWNTs-IL(BF4-),(e) MWNTs-IL(PF6-), (f) MWNTs-IL(H2PO4-).

修飾前后的碳納米管固定化CALB的固定化效率及酶活力情況如表 1所示。從表格中可以看出，具有不同陰離子的離子液體修飾碳納米管固定化酶的負載量略有差異，其中 MWNTs-IL(H2PO4-)-CALB的負載量最高為 81 mg·g-1，是Rastian等27利用等離子體修飾的MWNTs固定化CALB的負載量的 4倍。在此，酶分子與離子液體功能基團之間存在靜電、氫鍵、疏水、范德華力等相互作用28-30。所有離子液體修飾的MWNTs固定化CALB的活性都有了明顯提升，可能是由于載體表面的功能化離子液體的存在會使得酶與載體之間的分子作用力在一定程度上改變了酶蛋白構(gòu)象，使其活性位點暴露出來14-18。其中，以PF6-為陰離子的離子液體修飾載體固定化酶MWNTs-IL(PF6-)-CALB的酶活最高，展現(xiàn)出遠高于其它3種固定化酶生物活性，其比活力是未修飾的MWNTs-CALB的6.06倍，是Cao等31利用等離子體修飾的MWN Ts固定化CALB的活力的2.1倍。酶分子中的―OH、―NH2等基團有可能與載體表面的離子液體形成氫鍵,使得維持原構(gòu)象的次級鍵發(fā)生一定程度的變化，導致活性部位色氨酸殘基的微環(huán)境的改變，從而影響酶活32,33。相比其它幾種陰離子，PF6-具有較低的氫鍵形成能力，可以減少與酶分子的氫鍵作用34，而且其具有較低的親水性和親核性，可以減少溶劑與酶結(jié)構(gòu)中正電荷區(qū)的作用，從而使酶構(gòu)象改變緩慢35，而有較強的親水性和親核性的離子液體在一定程度上會破壞酶的折疊結(jié)構(gòu)使酶活降低32,33。該結(jié)果與Jiang等13研究具有不同陰離子的咪唑類離子液體修飾磁性納米材料固定化褶皺假絲酵母脂肪酶(CRL)得出的結(jié)論一致，當以 PF6-作為陰離子時，固定化酶的活性最高。此結(jié)果與本課題組之前研究具有不同陰離子的離子液體修飾SBA-15固定化PPL時，以 BF4-作為陰離子時固定化酶的活性最高的結(jié)論不同15。

3.2.1 固定化酶的最適溫度和最適pH

3.2.1.1 最適溫度

反應溫度對固定化 CALB活力的影響如圖 6所示，由圖可知，與游離酶的最適溫度(55 °C)相比，MWNTs-CALB 的最適溫度降低了 10 °C，而MWNTs-IL(Br-)-CALB、MWNTs-IL(BF4-)-CALB、MWNTs-IL(PF6-)-CALB、MWNTs-IL(H2PO4-)-CALB的最適溫度反而升高了 5 °C。相比于游離酶和MWNTs-CALB，碳納米管經(jīng)離子液體修飾后，固定化CALB對高溫耐受性有所增強，可能是固定化酶體系當中離子液體的引入使得酶和載體之間的氫鍵、疏水作用以及靜電作用有所增強，降低了CALB的動能，增強了酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，減少了溫度對其的影響14-18。

圖3 (a) MWNTs, (b) MWNTs-COOH,(c) MWNTs-IL(PF6)的拉曼光譜圖Fig.3 Raman spectra for (a) MWNTs,(b) MWNTs-COOH, (c) MWNTs-IL (PF6).

圖4 修飾前后載體的TGA圖Fig.4 TGA curves of pristine MWNTs and functionalized MWNTs.

3.2.1.2 最適pH

圖7揭示了固定化CALB在pH 6.0-9.5范圍內(nèi)的酶活力，由圖可知，游離酶和MWNTs-CALB的最適pH值為7.0，而載體經(jīng)離子液體修飾后，固定化CALB的最適pH值升至8.0，且對高pH值的耐受性增強，這可能與載體表面的電荷有關(guān)36，碳納米管上負載的離子液體所具有的離子降低了固定化酶對pH值的敏感度，同時酶結(jié)構(gòu)的改變使得固定化酶的最適pH升至8.016,37。這與課題組之前離子液體修飾的SBA-15固定PPL時最適pH值有所降低，對低pH值的敏感度降低的現(xiàn)象有所不同14,17,18；與離子液體修飾的SiO2固定PPL時最適pH值升高，對高pH值的敏感度降低的現(xiàn)象相同16。

3.2.2 固定化酶的穩(wěn)定性

3.2.2.1 熱穩(wěn)定性

圖5 MWNTs-COOH和MWNTs-IL (PF6)的XPS圖譜Fig.5 (a) N (1s) region of MWNTs-COOH and MWNTs-IL (PF6-). (b) P (2p) region of MWNTs-COOH and MWNTs-IL (PF6-). (c) F (1s) region of MWNTs-COOH and MWNTs-IL (PF6-).

固定化酶的熱穩(wěn)定性在酶促反應中非常重要。修飾前后的碳納米管固定化CALB的熱穩(wěn)定性如圖8所示，MWNTs-CALB的熱穩(wěn)定性最差，70 °C溫浴20 min后，基本喪失酶活。而MWNTs-IL(Br-)-CALB、MWNTs-IL(BF4-)-CALB、MWNTs-IL(PF6-)-CALB、MWNTs-IL(H2PO4-)-CALB的熱穩(wěn)定性都有一定程度的提高，其中，MWNTs-IL(Br-)-CALB的熱穩(wěn)定性最好，保溫20 min后，其殘余酶活力為初始酶活力的22%。這可能是載體上離子液體與酶蛋白分子之間的氫鍵、疏水作用及靜電相互作用，使其剛性結(jié)構(gòu)增強，阻止酶的構(gòu)象因高溫而受到破壞14-18。

表1 CALB的固定化效率及酶活Table 1 Results of immobilization process of CALB.

3.2.2.2 重復使用性

固定化酶的重復使用性在工業(yè)化應用過程中也是一項重要的指標之一，圖 9展示了各固定化CALB的重復使用性。由圖可以看出，在每次循環(huán)使用后，固定化CALB的酶活力均有所下降，離子液體修飾后的碳納米管固定化CALB的重復使用性能均有所提高，固定化CALB的酶活均有所下降，在重復使用4次后，MWNTs-CALB、MWNTs-IL(Br-)-CALB、MWNTs-IL(BF4-)-CALB、MWNTs-IL(PF6-)-CALB、MWNTs-IL(H2PO4-)-CALB的殘余活力分別為2.12%、26.44%、18.38%、20.67%、17.35%，離子液體加強了酶與碳納米管之間的疏水作用力、氫鍵作用力及吸附作用，使得酶的結(jié)構(gòu)在重復使用過程中不易被破壞14-18。

圖6 溫度對固定化酶酶活的影響Fig.6 Effect of temperature on the activity of the immobilized lipases.

圖7 pH對固定化酶酶活的影響Fig.7 Effect of pH on the activity of the immobilized lipases.

3.2.3 酶促反應動力學參數(shù)

圖8 各固定化酶的熱穩(wěn)定性Fig.8 Thermal stability of the immobilized lipases.

圖9 各固定化酶的重復使用性Fig.9 Reusability of the immobilized lipases.

表2 固定化酶的動力學常數(shù)Km和VmaxTable 2 Km and Vmax values of immobilized lipases from the Line weaver-Burk plot.

表3 固定化酶和游離酶中不同二級結(jié)構(gòu)的含量Table 3 Fractions of different secondary structures of immobilized enzymes and free enzyme.

酶促反應動力學主要用于考察酶催化的反應速率和各種因素對反應速度的影響。動力學研究為確定酶催化最佳反應條件和最大化酶催化反應效率提供了有力的手段。Km值代表酶和底物之間的親合力，Km值越高代表酶與底物的親和力越低。動力學參數(shù)Vmax代表酶的最大反應速度，反映了固定化酶的特性。

本實驗根據(jù)米氏方程(公式(3))來考察修飾前后的固定化酶的Km和Vmax的變化。

酶的Km及Vmax，結(jié)果如表2所示。MWNTs-CALB、MWNTs-IL(Br-)-CALB、MWNTs-IL(BF4-)-CALB、MWNTs-IL(PF6-)-CALB及 MWNTs-IL(H2PO4-)-CALB的Km分別為25.16、14.59、4.11、5.84、8.42 mg·mL-1，離子液體修飾的碳納米管固定化CALB對底物的親和力高于MWNTs-CALB，進一步說明離子液體的引入增強了酶與底物之間的親和力。

3.2.4 圓二色性光譜分析

圖10 固定化酶和游離酶的CD光譜圖Fig.10 CD spectrum of immobilized enzymes and free enzyme.

圓二色譜主要是利用蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的不對稱性檢測酶分子二級結(jié)構(gòu)的變化。本實驗選擇酶活最高的MWNTs-IL(PF6-)-CALB和穩(wěn)定性最好的MWNTs-IL(Br-)-CALB作為考察對象與游離酶及未修飾碳管固定化酶 MWNTs-CALB做對比，分析其二級結(jié)構(gòu)的變化對酶學性能產(chǎn)生的影響。根據(jù)CD譜圖與數(shù)據(jù)分析（如圖10和表3），可以發(fā)現(xiàn)3種固定化酶的α螺旋均出現(xiàn)了一定程度的下降，MWNTs-IL(PF6-)-CALB的變化幅度較小，說明固定化過程對酶的活性位點造成的影響較小，酶活損失較低；固定化酶 MWNTs-IL(Br-)-CALB的 β折疊顯示出一個明顯上升，說明酶的剛性得到一定程度的增強，其穩(wěn)定性得以提升38，與之前的實驗結(jié)果相印證。

4 結(jié)論

本文利用具有不同陰離子的功能化離子液體修飾碳納米管，對修飾后的載體進行了TEM、RS、TGA和XPS等表征，然后將CALB固定于修飾后的碳納米管上，并考察其酶學性質(zhì)，得出以下結(jié)論：通過 MWNTs表面改性使載體表面連接上具有不同的陰離子(Br-、BF4-、PF6-、H2PO4-)的離子液體這一過程并沒有破壞碳納米管的結(jié)構(gòu)完整性，并通過對各固定化CALB的動力學參數(shù)的考察，證實了離子液體的引入增強了酶與底物之間的親和力。碳納米管經(jīng)離子液體修飾后，相比于未經(jīng)修飾的 MWNTs-CALB，固定化 CALB的活性都有了明顯提高，對高溫、高pH值耐受性有所增強，熱穩(wěn)定性和重復使用性也都有一定程度的提高。離子液體的陰離子不同對修飾碳納米管固定化CALB的酶學性能有很大程度的影響，當以PF6-作為離子液體的陰離子時，固定化酶的比活力最高，達到 13636 U·g-1，是未修飾的 MWNTs-CALB的6倍；而以Br-作為離子液體的陰離子時，固定化酶的熱穩(wěn)定性得到最好的改善。

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