侯亞飛, 王 侃,2, 秦偉健, 肖 琨，顏文強(qiáng)，崔大祥,2

(1.上海交通大學(xué) 電子信息與電氣工程學(xué)院 儀器科學(xué)與工程系,上海 200240；2.上海智能診療儀器工程技術(shù)研究中心，上海 200240)

0 引 言

被廣泛應(yīng)用于即時(shí)檢測(cè)(point-of-care test，POCT)[1～3]行業(yè)的熒光免疫層析芯片具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、生物相容性好、速度快等優(yōu)點(diǎn)[3]，并且結(jié)合傳感器技術(shù)和便攜式檢測(cè)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記物的定量檢測(cè)。生物相關(guān)的傳感器和檢測(cè)系統(tǒng)也逐漸成為研究熱點(diǎn)[4～6]。目前，熒光免疫層析芯片的檢測(cè)系統(tǒng)主要基于臺(tái)式計(jì)算機(jī)處理或者嵌入式技術(shù)開(kāi)發(fā)，體積大，便攜性差，檢測(cè)速度有待提高。前期研究中，基于嵌入式技術(shù)實(shí)現(xiàn)的血液中C反應(yīng)蛋白檢測(cè)系統(tǒng)，整體變異系數(shù)高、穩(wěn)定性差[7]。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)的掃描式熒光檢測(cè)系統(tǒng)存在檢測(cè)速度慢的不足[8]。隨著智能手機(jī)的普及，開(kāi)發(fā)基于智能手機(jī)的快速定量芯片檢測(cè)系統(tǒng)具有極大的應(yīng)用前景[9,10]。

本文針對(duì)熒光免疫層析芯片檢測(cè)系統(tǒng)，開(kāi)發(fā)了一種應(yīng)用于智能手機(jī)的熒光芯片圖像特征提取和識(shí)別的方法，識(shí)別熒光芯片的信號(hào)區(qū)域并提取信號(hào)強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)表明:能夠準(zhǔn)確識(shí)別熒光芯片的信號(hào)區(qū)域，并準(zhǔn)確提取信號(hào)強(qiáng)度。在熒光免疫層析芯片檢測(cè)系統(tǒng)中，熒光信號(hào)強(qiáng)度和分析物濃度呈正相關(guān)。表明該熒光信號(hào)提取方法準(zhǔn)確，適用于基于智能手機(jī)的熒光芯片檢測(cè)系統(tǒng)。

1 方 法

1.1 免疫層析芯片結(jié)構(gòu)

免疫層析芯片主要包括5個(gè)部分：樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素((nitro-cellulose filter,NC)薄膜、吸收墊和聚氯乙烯 (polyvinyl chloride,PVC)背板。結(jié)構(gòu)如圖1所示。PVC背板用于提供結(jié)構(gòu)支持；樣品墊用于滴加待測(cè)樣品；結(jié)合墊用于固定熒光免疫探針，結(jié)合墊的一部分延伸到樣品墊下方，使得待測(cè)樣品和結(jié)合墊上抗體充分反應(yīng)；硝酸纖維素薄膜用于固定抗體和二抗，分別作為檢測(cè)線(test line ,T線)和控制線(control line,C線)；吸收墊用于提供層析的動(dòng)力，同時(shí)將多余的液體樣品吸收，以降低對(duì)信號(hào)判讀和檢測(cè)的影響。

圖1 熒光免疫層析芯片結(jié)構(gòu)

1.2 免疫層析芯片層析原理

熒光免疫層析技術(shù)是將免疫標(biāo)記技術(shù)與層析技術(shù)結(jié)合的一種新型檢測(cè)技術(shù)，利用熒光標(biāo)記物被激發(fā)后的熒光顯色特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的定性及定量分析。由于硝酸纖維素膜是微孔結(jié)構(gòu)，以其為固相載體，待測(cè)液為流動(dòng)相，利用微孔濾膜的毛細(xì)及虹吸作用引導(dǎo)待測(cè)液體向前流動(dòng)，同時(shí)待測(cè)液中的相關(guān)成分和固定在NC膜上的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物后，滯留在檢測(cè)區(qū)域，形成T線和C線。通過(guò)對(duì)標(biāo)記物熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，得到定量的檢測(cè)結(jié)果。整個(gè)層析過(guò)程用時(shí)約2～4 min。

1.3 免疫層析芯片信號(hào)區(qū)域識(shí)別與信號(hào)強(qiáng)度提取

如圖1所示，有效的信號(hào)區(qū)域?yàn)榫匦谓Y(jié)構(gòu)，首先要確定矩形區(qū)域的坐標(biāo)位置，然后再提取信號(hào)區(qū)域的熒光信號(hào)強(qiáng)度。通過(guò)對(duì)比多種圖像處理方法，最終采取的處理步驟包括：灰度化處理，改進(jìn)的Sobel算子進(jìn)行卷積運(yùn)算，閾值分析，二值化，投影法獲取檢測(cè)區(qū)域邊界坐標(biāo)，對(duì)信號(hào)區(qū)域的色彩值提取。算法流程如圖2。

圖2 圖像處理算法流程

1)將色彩的紅綠藍(lán) (red，green，blue，RGB)三通道的圖像轉(zhuǎn)化為單通道的灰度圖像，得到灰度圖像后，使用改進(jìn)的Sobel算子進(jìn)行卷積運(yùn)算提取圖像邊界。對(duì)比相關(guān)邊緣檢測(cè)算子，對(duì)于圖像邊界處理改進(jìn)的Sobel算子更能突顯邊界去除背景干擾。另外，對(duì)比了霍夫直線檢測(cè)算法，雖然該算法對(duì)于檢測(cè)直線有一定的優(yōu)越性，而且芯片圖像上以直線為主，但是該算法實(shí)際應(yīng)用比較耗時(shí)。因此，最終使用改進(jìn)的Sobel算子進(jìn)行邊界提取

(1)

2)將經(jīng)過(guò)卷積運(yùn)算之后的圖像進(jìn)行閾值分割，進(jìn)行二值化處理。分別使用最佳閾值分割法、直方閾值選擇法和多次實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行閾值計(jì)算。最佳閾值分割法單獨(dú)使用效果雖好，但是比較耗時(shí)。在檢測(cè)環(huán)境不變的情況下，每次處理的芯片圖像結(jié)構(gòu)相似，所以,將最佳閾值分割法求得的閾值作為參考值固定在程序中。然后將高于閾值的像素值置為0(黑色)，低于閾值的像素值置為1(白色)，從而實(shí)現(xiàn)邊界區(qū)域與背景區(qū)域的分離，如圖3所示。

圖3 芯片坐標(biāo)標(biāo)識(shí)

3)進(jìn)行圖像中邊界位置的確定(如圖3標(biāo)示的坐標(biāo)點(diǎn))。首先檢測(cè)左右邊界的坐標(biāo)值(Left_x和Right_x，如圖3所標(biāo)識(shí))。研究分別對(duì)比了2種算法：二分求極值和中心擴(kuò)展法。二分求極值法，先將二值化圖像矩陣中每一列像素值求和，得到一個(gè)一維數(shù)組，數(shù)組從中間分開(kāi)，分別對(duì)前半部分求最大值及其對(duì)應(yīng)的坐標(biāo)值，得到了左右邊界的坐標(biāo)位置。中心擴(kuò)展方法，同樣將二值化圖像矩陣中每一列像素值求和，得到的一維數(shù)組，從中間向兩邊擴(kuò)展的過(guò)程中，設(shè)定一個(gè)閾值如式(2)～式(5)，一旦超過(guò)閾值T便認(rèn)為找到了邊界。由于邊界線具有一定的寬度，二分求極值法的獲取的是邊界線在其寬度范圍內(nèi)的中心位置；中心擴(kuò)展方法則計(jì)算得到的是左右邊界線寬度范圍內(nèi)的內(nèi)邊距的位置。實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖谦@取信號(hào)區(qū)域，因此,界定的其邊界范圍要適當(dāng)排除邊界線的干擾，因此,第二種方法更準(zhǔn)確一些。通過(guò)偽代碼程序(1～16行)分別計(jì)算出芯片的左右邊界值

(2)

(3)

(4)

(5)

式中S(xi,yj)為M×N的圖像中像素值；X(i)為M×N的矩陣中第i列元素的和；Xextr1和Xextr2分別為兩個(gè)極大值。

1.Int get_left_x(){

2.fromk=N/2 to 0

3.ifX(k)>T

4.left_x=k;

5.return left_x;

6.end;

7.end;

8.}

9.Int get_right_x(){

10.fromk=N/2 toN

11.ifX(k)>T

12.right_x=k;

13.return right_x;

14.end;

15.end;

16.}

4)獲得T線和C線上下四條邊的縱坐標(biāo)(T_line_y1,T_line_y2,C_line_y1和C_line_y2，如圖3所示)。采用了兩步法：1)將二值化圖像矩陣中每一行的像素值相加，得到一個(gè)一維數(shù)組，并用輾轉(zhuǎn)求極值的方式，如式(6)～式(8)，求出的極值中找出4個(gè)最大值;2)將該坐標(biāo)值從小到大排列如式(9)，其中，n1為k1～k4中最小的一個(gè)，n2為k1～k4中次小值，其他以此類推。Y(j)為M×N的矩陣中第j行元素的和；Yextr(k)為Y(j)中的極大值，則T線和C線的邊界坐標(biāo)對(duì)應(yīng)式(10)～式(13)。

經(jīng)過(guò)上述理論分析從而實(shí)現(xiàn)芯片有效檢測(cè)區(qū)域的自動(dòng)準(zhǔn)確識(shí)別，相比于其他檢測(cè)設(shè)備具有很大的進(jìn)步，同時(shí)也增強(qiáng)了用戶體驗(yàn)

(6)

20≤k≤N-20

(7)

Yextr(k1)>Yextr(k2)>Yextr(k3)>Yextr(k4)

(8)

Sort(k1,k2,k3,k4)=[n1,n2,n3,n4|n1

(9)

C_line_y1=n3

(10)

C_line_y2=n4

(11)

T_line_y1=n1

(12)

T_line_y2=n2

(13)

2 MATLAB模擬仿真與智能平臺(tái)的仿真應(yīng)用

2.1 MATLAB模擬仿真

基于上述算法理論，首先,在MATLAB上實(shí)現(xiàn)了模擬計(jì)算用于可行性分析，對(duì)于信號(hào)區(qū)域邊界的提取方式符合預(yù)期結(jié)果。免疫層析芯片圖片實(shí)際的位置坐標(biāo)為left_x=170，right_x=331，T_line_y1=293，T_line_y2=350，C_line_y1=506，C_line_y2=565。圖4(a)和圖4(b)，將二值化圖像(圖3)按照每列求和和每行求和，分別得到兩個(gè)曲線，其中標(biāo)示出了峰值坐標(biāo)，與在芯片圖片的實(shí)際坐標(biāo)位置一致。

圖4 MATLAB芯片信號(hào)區(qū)域坐標(biāo)識(shí)別

對(duì)其區(qū)域信號(hào)進(jìn)行提取。對(duì)于圖像的信號(hào)處理，采用RGB色彩模式，分析每一個(gè)通道數(shù)據(jù)，針對(duì)于熒光芯片，根據(jù)圖5中3個(gè)通道信號(hào)強(qiáng)度對(duì)比，只有R通道信號(hào)最明顯，G和B通道基本無(wú)熒光信號(hào)強(qiáng)度的體現(xiàn)，因此，本文只需提取相應(yīng)的R通道數(shù)據(jù)進(jìn)行熒光信號(hào)。

圖5 熒光芯片RGB通道像素值

2.2 智能手機(jī)應(yīng)用

選擇基于Android系統(tǒng)的智能手機(jī)，采用Java編程語(yǔ)言，開(kāi)發(fā)手機(jī)端的應(yīng)用程序。最終，實(shí)際使用效果與MATLAB對(duì)比結(jié)果一致，詳見(jiàn)表1，驗(yàn)證了該算法的合理、可行性。如表1所示，原圖中對(duì)應(yīng)的坐標(biāo)位置和MATLAB計(jì)算的結(jié)果以及智能手機(jī)算法實(shí)現(xiàn)的結(jié)果基本一致。說(shuō)明了該方法對(duì)于區(qū)域圖像坐標(biāo)的識(shí)別具有良好的特性。圖6中，智能手機(jī)自動(dòng)使用線條標(biāo)示出了信號(hào)區(qū)域，完全符合預(yù)期。

表1 芯片信號(hào)區(qū)域位置坐標(biāo)

圖6 Android應(yīng)用軟件算法實(shí)現(xiàn)

3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

將該方法應(yīng)用于基于智能手機(jī)的熒光芯片檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。研究以癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)為熒光免疫層析芯片分析物，分別檢測(cè)不同濃度條件下系統(tǒng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度與濃度的相關(guān)性。樣品選用濃度依次為：1，2.5，5，10，20，30，40，50 ng/mL。檢測(cè)過(guò)程中，所有的信號(hào)區(qū)域均準(zhǔn)確地標(biāo)定出來(lái)。提取被標(biāo)定的區(qū)域熒光信號(hào)，計(jì)算T線和C線的熒光強(qiáng)度之比。比值與樣品濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，如圖7(a)所示。根據(jù)多次重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算樣品濃度和T線與C線的比值的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.093 8lnx+0.321 3，如圖7(b)所示，二者相關(guān)系數(shù)R2=0.948。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以實(shí)現(xiàn)快速、便捷的定量檢測(cè)樣品濃度。CEA的理論檢測(cè)下限達(dá)到0.03 ng/mL，相對(duì)于其他的檢測(cè)方法[11,12]，更加準(zhǔn)確，也更好地滿足臨床需求。進(jìn)一步驗(yàn)證了該算法不僅可以準(zhǔn)確識(shí)別芯片信號(hào)區(qū)域、提取熒光信號(hào)，而且適用于芯片監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中。

圖7 檢測(cè)儀器系統(tǒng)定量檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié) 論

經(jīng)過(guò)一系列的MATLAB仿真分析和驗(yàn)證，提出的熒光芯片信號(hào)區(qū)域提取方法不僅可以準(zhǔn)確地識(shí)別熒光芯片的信號(hào)定位，而且合理地提取了熒光信號(hào)，進(jìn)行處理分析，得到滿意的定量檢測(cè)結(jié)果。將方法應(yīng)用到基于智能手機(jī)的檢測(cè)程序中，可以實(shí)現(xiàn)快速、高效、便捷的熒光層析芯片定量檢測(cè)。通過(guò)臨床應(yīng)用進(jìn)一步驗(yàn)證了算法的合理性和準(zhǔn)確性。檢測(cè)方法具有很高的實(shí)用性和可移植性，可應(yīng)用于不同的移動(dòng)客戶端芯片檢測(cè)系統(tǒng)中，并且可方便地拓展到多指標(biāo)的芯片檢測(cè)系統(tǒng)中。

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崔大祥(1967-)，男，通訊作者，教授，長(zhǎng)江特聘教授，博士生導(dǎo)師，國(guó)家杰出青年基金獲得者，納米重大科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目首席科學(xué)家,主要研究領(lǐng)域?yàn)榧{米材料的制備、生物學(xué)效應(yīng)與安全性評(píng)價(jià)，基于納米粒子標(biāo)記與納米效應(yīng)的腫瘤早期診斷系統(tǒng)與傳感器的研制，多功能納米探針與腫瘤的分子影像，胃癌相關(guān)的基因與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究，基于納米技術(shù)的CIK與干細(xì)胞治療，高效基因或藥物遞送系統(tǒng)，E—mail：wk_xa@163.com。