葉松華，王曉燕，董曉麗，馮夏珍，楊瑩瑩

（山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西太原030006）

惡性腫瘤是常見且嚴(yán)重威脅人類生命主要疾病之一，尋找有效的抗腫瘤藥物與方法，是世界醫(yī)學(xué)界重要的研究課題。天然產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)獨特、生物活性廣泛、不易耐藥等優(yōu)點，是發(fā)掘新穎抗腫瘤活性成分的重要源泉，也是有機合成和組合化學(xué)的補充。從天然植物中尋找活性成分，大規(guī)模快速篩選先導(dǎo)化合物，是發(fā)現(xiàn)新型天然抗腫瘤藥物先進、快速、有效的篩選途徑［1-2］。建立合理的抗腫瘤藥物篩選的方法和高效、簡便的篩選模型對抗腫瘤藥物的研究具有重要的意義。

快速熒光素測定法是一種近幾年發(fā)展起來的體外藥物敏感性測定方法［3］，該技術(shù)因其具有簡便、靈敏、穩(wěn)定等特點得到了廣泛應(yīng)用，并已成為高通量篩選的關(guān)鍵技術(shù)之一。其原理是通過細胞酶的作用使無熒光性的材料分解或轉(zhuǎn)換為熒光材料，通過測定熒光強度從而測定出活細胞的量。二乙酸熒光素（FDA）是一個非極性酯類化合物，能通過完整的細胞膜，在活細胞內(nèi)被酯酶水解而產(chǎn)生極性的綠色熒光物質(zhì)，該熒光物質(zhì)不能通過完整的細胞膜，能在活細胞內(nèi)保留，因此可用于活細胞標(biāo)記并測定細胞活力［4-5］。

本研究建立了一種基于FDA標(biāo)記活細胞的抗腫瘤活性物質(zhì)快速篩選方法，并應(yīng)用該方法對兩種藥用植物的抗腫瘤活性組分進行了初篩，為天然產(chǎn)物抗腫瘤活性物質(zhì)研究提供了新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MEM培養(yǎng)基購自Gibco公司、胎牛血清（FBS）購自BI公司；熒光染料二乙酸熒光素（FDA）購自Sigma公司；青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；阿霉素對照品、牛胰島素、非必需氨基酸、丙酮酸鈉購自北京索萊寶科技有限公司。96孔細胞培養(yǎng)板，細胞培養(yǎng)瓶購自Coming公司。沙煲暗羅莖、海南染木樹葉采自海南昌江縣霸王嶺自然保護區(qū)。乳腺癌細胞系MCF-7購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 實驗儀器

熒光倒置顯微鏡（德國ZEISS）；多功能微孔讀板機 SyergyH1（美國伯騰）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo）；HH數(shù)顯三用恒溫水箱（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）；超凈臺（蘇州凈化SW-CJ-2D）；低速離心機SC-3610（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；藥物抑制濃度計算軟件（GraphPad Prism 5.0，美國）。

1.3 熒光測定法的建立及考察

1.3.1 FDA濃度的選擇 取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，以0.25%胰蛋白酶消化后，以3 000個/孔接種于96孔板中間60孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，棄去每孔中培養(yǎng)液，用PBS漂洗2次，加入100 μL/孔含系列濃度梯度 FDA（40 μg/mL，20 μg/mL，10μg/mL，5 μg/mL，2.5 μg/mL，1.25 μg/mL，0.625 μg/mL，0.313 μg/mL，0.156 μg/mL，0.078 μg/mL） 的 PBS溶液，每個濃度3個復(fù)孔，37℃培養(yǎng)孵育45 min后，立即置于多功能微孔讀板機上，在激發(fā)波長為490 nm，發(fā)散波長為526 nm的條件下檢測每孔的熒光強度，并繪制探針濃度和熒光強度的關(guān)系圖。

1.3.2 方法的線性范圍考察 取處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞，以0.25%胰蛋白酶消化后，從1.5萬個/孔按照倍半稀釋的方式稀釋為10個濃度，接種于96孔板的中間60孔，每個密度設(shè)3個復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，棄去每孔中培養(yǎng)液，用100 μL PBS 漂洗 2次，用含 FDA（2.5 μg/mL）的 PBS標(biāo)記細胞，每孔 100 μL，37 ℃，孵育 45 min，立即置于多功能微孔讀板機上檢測每孔的熒光強度。以每孔的細胞個數(shù)為橫坐標(biāo)，熒光強度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。

1.3.3 方法的精密度考察 取處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞，以0.25%胰蛋白酶消化后，以3 000個/孔接種于96孔板的中間60孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，棄去每孔中培養(yǎng)液，按1.3.2項操作檢測每孔的熒光強度，計算各孔熒光強度間的RSD，以考察該種方法的精密度。

1.3.4 方法的準(zhǔn)確性驗證 按常規(guī)方法接種腫瘤細胞，3 000個/孔。培養(yǎng)24 h后，加藥組每孔加入100 μL含不同濃度阿霉素的培養(yǎng)液，阿霉素的終濃度分別為：40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL、0.625 μg/mL，每個濃度設(shè) 3個復(fù)孔。陰性對照組加入相同體積培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，棄去每孔中培養(yǎng)液，按1.3.2項操作檢測每孔的熒光強度，并按照下面的公式計算不同濃度阿霉素對腫瘤細胞的抑制率：抑制率（%）=（1-加藥組熒光強度值／對照組熒光強度值）×100%。

1.4 藥用植物化學(xué)組分的制備

將自然風(fēng)干的沙煲暗羅莖進行粉碎，然后用95%乙醇浸提3次，每次7 d，將收集到的浸提液合并、減壓蒸餾，最后得到乙醇總浸膏。然后將乙醇總浸膏分散于一定量的蒸餾水中，分別用石油醚和乙酸乙酯萃取3次，將所得的萃取液合并、減壓濃縮，得到各部位浸膏，分別標(biāo)記為1-1、1-2。

將海南染木樹葉粉末，用85%的乙醇溶液浸泡提取 3 次，分別為 3 d，5 d，7 d，合并濃縮，得粘稠狀浸膏；將浸膏分散在一定量的蒸餾水中，分別用石油醚、乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮得各極性部位浸膏，分別標(biāo)記為2-1、2-2。

1.5 藥用植物抗腫瘤活性部位的篩查

按常規(guī)方法接種腫瘤細胞，3 000個／孔。培養(yǎng)24 h后，加藥組每孔加入100 μL含不同濃度提取物的培養(yǎng)液，使終濃度分別為：400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、20 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。并分別以2.5μg/mL的鹽酸阿霉素和含0.1%DMSO的培養(yǎng)液作為陽性對照和陰性對照。培養(yǎng)48 h后，棄去每孔中培養(yǎng)液，按1.3.2項操作檢測每孔的熒光強度，計算不同組分對腫瘤細胞的抑制率。

2 結(jié)果

2.1 基于熒光信號的抗腫瘤活性物質(zhì)篩選方法的建立及考察

2.1.1 FDA濃度對熒光強度的影響 本研究考察了10個不同熒光染料濃度下的細胞熒光信號強度。當(dāng)FDA濃度達到≥20 μg/mL時出現(xiàn)平臺期（圖1中A）；而探針質(zhì)量濃度在0～5 μg/mL時，細胞的熒光強度隨著FDA濃度增加而增強（R2=0.987 8）（圖1中B）。當(dāng)探針質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL時，已能滿足軟件統(tǒng)計的要求，而濃度過大會產(chǎn)生較強的背景干擾，同時染料濃度過高可能會對細胞活力產(chǎn)生影響，故本文FDA染料濃度定為2.5 μg/mL。

2.1.2 方法學(xué)研究結(jié)果 實驗結(jié)果表明（如圖2），每孔接種細胞在68～1.5×104個/孔的范圍內(nèi)，熒光強度與每孔接種細胞數(shù)之間的線性關(guān)系良好，計算回歸方程得，y=1.892 4x-534.16，R2=0.9967。連續(xù)掃描整個96孔板中60孔，發(fā)現(xiàn)其熒光強度變化值較小，其RSD為10.9%，表明該方法具有良好的板內(nèi)精密度。

圖1 FDA濃度對熒光強度的影響

圖2 細胞密度與熒光強度的線性關(guān)系

2.1.3 方法的準(zhǔn)確性驗證 選擇鹽酸阿霉素作為陽性藥對建立的方法進行驗證，以考察本方法的可靠性，實驗結(jié)果如圖3所示。計算所得鹽酸阿霉素抑制MCF-7細胞增殖的IC50值為3.04 μg/mL，與歐金來等［6］使用MTT法所檢測到的結(jié)果2.7 μg/mL較為一致，說明本方法用于抗腫瘤活性物質(zhì)篩選是準(zhǔn)確可靠的。

圖3 鹽酸阿霉素對MCF-7細胞的抑制率與劑量的關(guān)系曲線

2.2 藥用植物抗腫瘤活性部位的篩查

分別對沙煲暗羅莖和海南染木樹葉的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物（1-1，2-1）和石油醚萃取物（1-2，2-2），結(jié)果見表1。結(jié)果表明沙煲暗羅莖乙酸乙酯部位和石油醚部位、海南染木樹葉石油醚部位對MCF-7細胞均有抑制作用且呈現(xiàn)劑量依賴性，經(jīng)計算以上三個部位的IC50值分別為134.1 μg/mL、78.46 μg/mL 和 86.87 μg/mL。而海南染木樹葉乙酸乙酯部位對MCF-7增殖的抑制作用不明顯，只在最高濃度有較弱的抑制作用。

表1 各組分對MCF-7細胞的抑制率 （%）

根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)，沙煲暗羅莖石油醚部位在濃度400 μg/mL時的抑制率為68.51%，反而低于200 μg/mL時的抑制率，這是由于該部位由高濃度的DMSO溶液向培養(yǎng)基溶液稀釋的過程中，出現(xiàn)了較多的析出，使得培養(yǎng)基中的實際藥物濃度不準(zhǔn)確。因此，在計算IC50時，為保證結(jié)果的可靠性，只使用了6.25～200 μg/mL的數(shù)據(jù)。

3 討論

本研究經(jīng)過篩選合適的FDA濃度，建立了一種基于FDA熒光信號的抗腫瘤活性物質(zhì)體外快速篩選方法，并用鹽酸阿霉素做為陽性藥對該方法進行了可靠性驗證。經(jīng)過線性范圍和精密度的研究，對該方法進行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明，本方法在68～1.5×104個/孔的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。李寧等［7］對CCK-8法和MTT法檢測人前列腺癌PC3細胞活性的最佳條件進行了比較，發(fā)現(xiàn)CCK-8法和MTT法檢測PC細胞活細胞數(shù)時，線性范圍分別是 8×102～5×104和 6.3×102～5×104。因此，本方法與傳統(tǒng)的體外抗腫瘤活性物質(zhì)篩選的方法相比，具有更高的靈敏性和更寬的線性范圍。

應(yīng)用熒光檢測法對沙煲暗羅莖和海南染木樹葉進行了抗腫瘤活性篩選，結(jié)果表明沙煲暗羅莖乙酸乙酯部位和石油醚部位、海南染木樹葉石油醚部位對MCF-7細胞均有抑制作用且呈現(xiàn)劑量依賴性，為這兩種藥用植物抗腫瘤活性物質(zhì)的進一步篩選和以及抗腫瘤單體分離奠定了基礎(chǔ)。

本研究建立的熒光檢測法具有快速、靈敏、細胞線性范圍寬等特點，可用于天然產(chǎn)物抗腫瘤活性物質(zhì)的體外快速高通量篩選，為天然產(chǎn)物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了新的研究手段。

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