徐 珍，李 倩，劉亮亮，郭愛華

（山西職工醫(yī)學院，山西晉中030619）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根［1］。黃芪中含有多種重要的活性成分，其中黃酮類成分具有免疫調(diào)節(jié)、抗損傷、抗突變、抗腫瘤、抑制動脈粥樣硬化等活性［2］。

隨著對黃芪深入研究，它不僅可供藥用，還被開發(fā)為保健品、食品及化妝品等廣泛使用，使得黃芪市場出現(xiàn)了供不應(yīng)求的局面。

黃芪種植地域性廣，但其中山西黃芪的種植方式和生長年限最接近傳統(tǒng)野生資源，商品藥材的性狀幾乎與野生黃芪無區(qū)別，但占用土地年限長，因根深采刨困難，提高了生長成本，故產(chǎn)量有限［3］。黃芪根入藥時，大量地上部分被丟棄或焚燒，造成很大的藥源資源浪費。

山西省渾源縣是黃芪道地產(chǎn)品“正北芪”的原產(chǎn)地，素有“中國黃芪之鄉(xiāng)”“正北芪之鄉(xiāng)”的美譽。

課題組以渾源黃芪地上部分（莖、葉、種、稈）作為研究對象，以地下部分作為對比，對其中黃酮類成分進行定性、定量研究，旨在開發(fā)黃芪藥材新的藥用部位，為渾源黃芪地上部分科學合理的應(yīng)用提供依據(jù)，進一步擴大黃芪藥用資源的利用價值。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent Chemstation色譜工作站、VDW 1314B紫外可見檢測器、G1311A四元泵、G1316A柱溫箱，美國安捷倫公司）；B-220型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、XB120A型電子分析天平（上海精密化學儀器制造廠）、TCQ-250型超聲波清洗機（北京醫(yī)療設(shè)備生產(chǎn)二廠）。

1.2 實驗試劑

芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（購于上海永恒生物科技有限公司，批號為20120528、20120428）；芒柄花苷、毛蕊異黃酮對照品（購于成都曼斯特生物科技有限公司，批號為13021808、13021808）；3-羥基-9，10-二甲基紫檀烷、7，2′-二羥基-3′，4′-二甲氧基異黃烷對照品（購于江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，批號為YJ150718、YJ150717），各對照品質(zhì)量分數(shù)均大于98%。乙腈（美國Fisher公司，色譜純）、純凈水（娃哈哈牌），甲醇等其余試劑均為分析純。

1.3 實驗藥材

本實驗所用藥材由山西省道地藥材——渾源黃芪藥材種植基地提供，經(jīng)山西醫(yī)科大學藥學院白云娥教授鑒定為豆科植物蒙古黃芪的干燥根及地上部分（莖、葉、種、稈）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動相為乙腈（A）-水（B），體積流量 1.0 mL/min，Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），紫外檢測波長 230 nm，柱溫 25 ℃，進樣量 20 μL［4］。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

2.2 配制對照品溶液

本實驗采用多指標定量法對黃芪中6種黃酮類成分進行同時測定，故對照品應(yīng)配制成混合對照品溶液，即該溶液中含有含量已知的6種黃酮類對照品。具體配制方法如下：精密稱取對照品適量置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，由此，可得到6種黃酮化合物各自的對照品儲備液。然后每種儲備液取適量，置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，即制得混合對照品溶液（A）。各儲備液濃度及混合對照品溶液中各成分濃度見表2。

表2 混合對照品溶液各成分濃度表

2.3 供試品溶液的制備

劉宗彬等［5］通過單因素實驗考察黃芪黃酮最佳提取工藝條件為：顆粒細度0.075～0.25 mm之間，超聲20 min，料液比達到1∶15，乙醇濃度為80%。

取黃芪藥材，粉碎，過80目篩，備用。精密稱取黃芪地上部分、地下部分粉末各5 g，放入錐形瓶（具塞）中，加15倍量的80%乙醇，超聲20 min，提取2次，合并濾液，濾過，置于水浴鍋上蒸餾濃縮至干，用甲醇將殘渣溶解后定容至10 mL容量瓶中，振搖、混勻，即可。

2.4 標準曲線的制備

以對照品的濃度為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，可得線性回歸方程。

本實驗中作為橫坐標的一系列對照品的濃度是將“對照品溶液的配置”中制備的6種對照品的儲備液按照原溶液濃度的1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍、1/16倍、1/32倍、1/64倍稀釋，每個對照品制成7種不同濃度的溶液，分別用0.45 μm的濾膜過濾，進樣量20 μL，記錄峰面積的積分值。6種對照品的線性回歸方程結(jié)果見表3。

表3 對照品線性回歸方程及其線性范圍

6種對照品在各自的線性范圍內(nèi)都表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度實驗 取混合對照品溶液（A）10μL，采用2.1項下的色譜條件，連續(xù)進樣，共6次，依據(jù)峰面積積分值分別計算其RSD值。結(jié)果見表4。6種黃酮類成分RSD值都小于2.0%，提示該方法符合實驗要求?；旌蠈φ掌罚ˋ）HPLC色譜圖見圖1。

2.5.2 穩(wěn)定性實驗 依據(jù)“2.3供試品溶液制備方法”制作黃芪地上、地下部分的供試品溶液，每隔2 h進樣檢測，12 h內(nèi)共檢測6次。針對不同成分的峰面積積分值計算其RSD值。結(jié)果見表4。RSD值均小于3.0%，表明各供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復性實驗 精密稱取黃芪地上部分藥材樣品6份，每份1 g，按本實驗方法制備成供試品溶液，進行HPLC檢測。結(jié)果見表4。RSD值都低于2.5%，表明該實驗方法具有良好的重復性。

2.5.4 加樣回收實驗 準備黃芪地上、地下部分藥材樣品6份（要求已知藥材中藥物含量），制成供試品溶液，量取供試品溶液2 mL，將其置于5mL棕色容量瓶中，加入2.2項下制備的對照品儲備液1 mL，再加甲醇定容至滿刻度，振搖，混勻。再進行HPLC檢測，測定各成分的峰面積，進而計算平均加樣回收率。結(jié)果見表4。

圖1 混合對照品（A）HPLC色譜圖

經(jīng)以上方法學考察，所建立的含量測定條件其精密度、穩(wěn)定性、重復性、回收率等均符合規(guī)定，可用于黃芪中黃酮類化學成分的含量測定。

2.6 含量測定

將供試品溶液稀釋至適宜濃度并進行HPLC含量檢測，進樣量為20 μL。結(jié)果見表5和圖2。

圖2 黃芪地上、地下部分中黃酮類成分種類與含量的比較

黃芪地上部分與地下部分均含有6種黃酮類成分：7，2′-二羥基-3′，4′-二甲氧基異黃烷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、3-羥基-9，10-二甲氧基紫檀烷。經(jīng)比較可以發(fā)現(xiàn)，黃芪地上部分中毛蕊異黃酮含量為地下部分的4倍，芒柄花苷含量為地下部分的2倍，7，2′-二羥基-3′，4′-二甲氧基異黃烷的含量約為地下部分的1.1倍，芒柄花素和3-羥基-9，10-二甲氧基紫檀烷含量差別不明顯，但地下部分中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量高于地上部分，約為2.5倍。黃芪地下部分總黃酮含量略高于地上部分。

3 討 論

中藥黃芪中有多個有效部位，包括總黃酮、總皂苷、多糖類等，具有多種生物活性，其中黃酮類化合物是黃芪中分離的抗氧化、清除自由基的主要活性成分，具有明顯的抗腫瘤、抗損傷和抗突變的作用［6］。

表4 方法學考察結(jié)果

本文對山西道地藥材——渾源黃芪地上部分與地下部分中黃酮類化合物進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪地上部分與地下部分所含黃酮類化合物種類相同，只是在含量上存有差別，除了毛蕊異黃酮葡萄糖苷（B）外，地上部分的芒柄花苷（A）、毛蕊異黃酮（C）、7，2′-二羥基-3′，4′-二甲氧基異黃烷（F）的含量明顯高于地下部分，而芒柄花素（D）和3-羥基-9，10-二甲氧基紫檀烷（E）的含量不低于地下部分，但就總黃酮含量來說，地下部分略高于地上部分。

表5 黃芪地上、地下部分黃酮類成分含量比較

以上結(jié)果為黃芪地上部分可利用價值進一步奠定了理論基礎(chǔ)。一方面，為擴大新藥源奠定了理論基礎(chǔ)，另一方面，如若能將黃芪地上部分充分利用，變廢為寶，還可增加黃芪種植基地的就業(yè)機會、提高企業(yè)經(jīng)濟效益和社會效益。

黃芪為春、秋兩季采摘，地上部分受氣候、季節(jié)影響較大，為充分利用黃芪地上部分，后續(xù)還將研究季節(jié)、氣候?qū)喸袋S芪地上部分化學成分的影響。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

［2］張薔，高文遠.黃芪中有效成分藥理活性研究進展［J］.中國中藥雜志，2012，37（21）：3 203-3 207.

［3］秦雪梅，李震宇.我國黃芪藥材資源現(xiàn)狀與分析［J］.中國中醫(yī)藥雜志，2013，38（19）：3 234-3 238.

［4］萬燕晴.基于化學成分的黃芪藥材質(zhì)量評價［D］.太原：山西大學，2015.

［5］劉宗彬，孫英華.黃芪黃酮的超聲輔助提取工藝研究［J］.白城師范學院學報，2015，29（5）：6-8.

［6］張冬青，汪德清.黃芪總黃酮生物活性作用研究進展［J］.中國中藥雜志，2010，35（2）：253-255.