孫羽中，陳富麗，竇志芳

（山西中醫(yī)藥大學，山西太原030024）

IBS作為多種癥狀存在的疾病，其發(fā)病機制十分復雜，目前尚未找到引起本病發(fā)生的真正原因，但多方研究顯示，IBS的發(fā)病與精神情緒密切相關。所以本實驗以IBS肝郁脾虛證為研究對象，以具有柔肝和脾作用的痛瀉要方為干預方法，以和精神情緒密切相關的5-羥色胺（5-HT）為切入點，探討痛瀉要方對腸易激綜合征肝郁脾虛證大鼠5-HT的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SD雄性大鼠120只，SPF級，體質量（180±20）g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK-（京）2012-0001；實驗前，將動物置于實驗室適應環(huán)境1 w，自由進食、飲水，室溫（22±2）℃，正常晝夜節(jié)律。實驗過程中實驗動物的飼養(yǎng)管理和實驗操作過程均遵守山西中醫(yī)藥大學實驗室相關規(guī)定。

1.1.2 藥材與試劑 番瀉葉、痛瀉要方顆粒劑（山西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院提供）；匹維溴銨（法國蘇威制藥廠）；5-HT試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司）；4%多聚甲醛固定液（石家莊四藥有限公司）；水合氯醛（天津市科密歐化學試劑有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司）。

1.1.3 實驗儀器 外科手術器械（上海浦倫醫(yī)療器械有限公司）；鼠斷頭器（安徽省淮北正華微生物儀器設備有限公司）；LT1002B電子天平（常熟市天量儀器有限責任公司）；HC-2062高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；KDC-1044低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；Fm100型雪花制冰機（美國格蘭特化學公司）；KQ-500型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SynergyTM H1全功能微孔板檢測儀（美國伯騰（BioTek）儀器有限公司）；IKA T25高性能數(shù)顯勻漿（分散）機（德國艾卡（IKA）公司）；EZQ-2旋渦振蕩器（江蘇省泰縣醫(yī)療器械公司）；LEICA RM2235石蠟切片機（德國Leica公司）；EG1150C石蠟包埋機（德國Leica公司）；EXCELSIOR ES脫水機（美國賽默飛世爾科技Thermo）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與給藥 SPF級SD雄性大鼠 120只，體質量（180±20）g，所有大鼠在恒濕、恒溫、自由進食、進水及晝夜光線的房間內飼養(yǎng)1 w后，隨機分為6組：正常組、病理組、痛瀉要方低劑量組、痛瀉要方中劑量組、痛瀉要方高劑量組、西藥（匹維溴銨）組，每組20只。造模過程中用番瀉葉進行灌胃，治療時，正常組及病理組大鼠給予生理鹽水，西藥組給予匹維溴銨，痛瀉要方低、中、高劑量組分別給予痛瀉要方相應濃度的溶液。

1.2.2 IBS肝郁脾虛證大鼠造模及治療 除正常組外，其余各組大鼠按照先肝郁后脾虛刺激制備IBS肝郁脾虛證動物模型。先用橡皮膠束縛大鼠前肢，使前肢無法正常運動，每天檢查一次，將掙脫橡皮膠的大鼠繼續(xù)束縛，此過程連續(xù)進行2 w。然后在束縛的基礎上進行番瀉葉灌胃，將配好的番瀉葉溶液按照每100 g大鼠灌胃1 mL的方法進行，每天灌胃1次，此過程持續(xù)7 d。

治療過程中，西藥（匹維溴銨）組、痛瀉要方低、中、高劑量組分別將各組配制好的溶液按照每100 g大鼠灌胃1 mL的方法進行，正常組及病理組給予等體積的生理鹽水，每天灌胃1次，持續(xù)7 d，然后進行相關指標的檢測。

1.3 指標監(jiān)測

1.3.1 血清5-HT含量的檢測 造模結束后第3 h，一般狀態(tài)觀察結束后，大鼠均按1 mL/100 g劑量灌服3%D-木糖溶液，1 h后麻醉大鼠，腹主動脈取血，肝素抗凝試管中搖勻，4℃低溫高速離心15min（3 000 r/min），取上層血漿，于-26 ℃冰箱凍存，檢測前速融。使用大鼠5-HT酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒檢測血清中5-HT的含量。

車身長/寬/高(mm) ..................................4543/2059/1196

1.3.2 結腸黏膜5-HT含量的檢測 采血結束，剖腹分離結腸和直腸段，截取結腸約6 cm，再等分為3個2 cm的結腸段，以生理鹽水沖洗，分別置入4%多聚甲醛固定液中，固定24 h后放入自動脫水機中自動脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片（5μm），備用。

石蠟切片微波爐抗原修復的操作步驟：①石蠟切片常規(guī)脫蠟，蒸餾水沖洗3次；②用3%H2O2孵育8 min（主要根據(jù)實驗室溫度及其他條件決定），阻斷內源性過氧化酶，用蒸餾水洗3次，每次5 min；③PBS沖洗3次，每次5 min；④把切片納入裝有0.01M枸櫞酸鹽緩沖液pH（6.0±0.1）的容器當中，放進微波爐內抗原修復10 min；⑤取出并在室溫自然冷卻后用PBS洗3次，每次5 min。

免疫組化染色步驟：①滴加適當?shù)?∶100稀釋兔抗鼠5-HT或NGF多克隆抗體，陰性對照用PBS代替一抗，4℃過夜；②用PBS沖洗3次，每次3 min；③滴加二抗工作液，在37℃孵育20 min；④用PBS沖洗3次，每次3 min；⑤DAB室溫顯色，光鏡下控制反應時間；⑥自來水充分沖洗；⑦蘇木素復染；⑧梯度酒精脫水，二甲苯透明中性樹膠封片。每張完成染色的切片在OlympsDP70光學顯微鏡高倍鏡400倍下觀察。

遠端結腸病理檢查：取距肛門5～6 cm處遠端結腸，用4%多聚甲醛固定液固定。HE染色后，顯微鏡下觀察以下內容：固有層有無中性粒細胞浸潤，間質有無水腫。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗結果分析、統(tǒng)計圖表繪制均采用Graphpad prism 5，統(tǒng)計結果以均數(shù)±標準差（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血清中5-HT含量

與正常組比較，病理組血清中5-HT含量明顯升高（P＜0.05）；與病理組比較，西藥組及痛瀉要方中、高劑量組5-HT含量顯著降低（P＜0.05），其中高劑量組含量最為接近正常組。結果見表1。

表1 各組大鼠血清中5-HT含量檢測結果 （ng/L，±s）

表1 各組大鼠血清中5-HT含量檢測結果 （ng/L，±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與病理組比較，2）P＜0.05

組別 n 5-H T正常組 2 0 1 4 9.9 3±3 2.5 7病理組 2 0 2 3 3.9 8±2 6.7 1 1）低劑量組 2 0 1 4 1.7 7±3 3.1 2中劑量組 2 0 1 6 6.2 2±3 3.3 9 2）高劑量組 2 0 1 5 2.9 2±2 9.0 5 2）西藥組 2 0 1 7 6.0 7±2 4.1 6 2）

2.2 結腸中5-HT含量

與病理組比較，治療各組均明顯下降，與正常組比較，病理組含量明顯升高。痛瀉要方高劑量組含量最接近正常組，痛瀉要方中劑量組、西藥組偏高。結果見圖1。

圖1 各組大鼠結腸5-HT免疫組化染色陽性細胞面積（Area）檢測結果

3 討論

3.1 IBS肝郁脾虛證是臨床中最常見證型

中醫(yī)沒有與IBS相對應的病名，按照臨床癥狀歸于中醫(yī)泄瀉、便秘、腹痛等類別。IBS作為中醫(yī)藥治療的優(yōu)勢病種，中醫(yī)診療共識意見將IBS分為肝郁氣滯、肝郁脾虛、脾胃濕熱、脾虛濕阻、腸道燥熱和脾腎陽虛6種證型。我們課題組對近20年相關文獻統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，IBS肝郁脾虛證出現(xiàn)頻率最高，占67.3%，而疏肝健脾法是臨床中治療IBS最主要的方法［2］。蔡俊晏［3］對我國近十年中醫(yī)藥治療IBS的臨床觀察文獻分析得出，肝郁脾虛證為臨床最常見證型，痛瀉要方是治療IBS肝郁脾虛證最常用方劑。

中醫(yī)理論認為，肝主疏泄，脾主運化，五行之中，肝木能夠克脾土，肝木克脾太過則導致泄瀉、便秘等腸道癥狀的發(fā)生。肝藏血，腦為髓海，腦髓依靠肝血的不斷充養(yǎng)方成腦神之用。腦為元神之府，主神明而總統(tǒng)諸神，腦是情志的最高指揮官。過度的情志刺激可傷及腦神，腦神失控，則導致情志失常，情志失常則影響肝之疏泄，肝失疏泄，克土太過，則影響脾的運化而導致腹痛、腹瀉、便秘等癥狀出現(xiàn)。肝主疏泄與藏血功能為聯(lián)系腦神與脾運化功能的樞紐，腦-肝-脾是中醫(yī)理論中有關消化方面最主要的臟器。

痛瀉要方具有補脾土泄肝木，調氣機止痛瀉的作用。方中白術味苦甘而性溫，有補脾燥濕之功，故可治土虛，是為君藥；白芍味酸性寒，有柔肝緩急止痛之功，與白術相配，有土中瀉木之效，是為臣藥；陳皮味辛苦而性溫，有理氣燥濕、醒脾和胃之功，是為佐藥；再配以防風少許，取其升散之性，與方中白術、芍藥相伍，其辛可散肝郁，其香可舒脾氣，并有勝濕以助止瀉之功效，又可作為脾經之引經藥，兼具佐使。四藥相伍使肝和脾健，痛瀉自止，是治療IBS肝郁脾虛證最為對癥的方劑。

現(xiàn)代醫(yī)學認為，腸道的神經支配及調節(jié)由腸道神經系統(tǒng)（ENS）和中樞神經系統(tǒng)（CNS）協(xié)同完成，胃腸運動通過神經反射將胃腸道與CNS聯(lián)系起來，在不同層次將胃腸道與中樞神經系統(tǒng)聯(lián)系起來的神經-內分泌網(wǎng)絡被稱為腦腸軸［4］。腦腸軸作為人體一個巨大的神經內分泌免疫網(wǎng)絡系統(tǒng)為雙向通路，一方面刺激和將內在信息通過腸神經鏈與高級神經中樞相連結影響胃腸感覺、動力和分泌等；另一方面親內臟作用又反過來作用于中樞的痛感、情緒和行為，即胃腸癥狀對心理狀態(tài)有反作用［5］，這就是精神情緒可以影響胃腸功能的原因。

無論是中醫(yī)的腦-肝-脾理論，還是現(xiàn)代醫(yī)學理論的腦腸軸學說，都顯示出心理狀態(tài)與腸道疾病有著莫大的聯(lián)系，而隨著社會的進步，人們在金錢、物質等方面得到滿足的同時精神壓力也在增加，這或許是肝郁脾虛證型占如此大比重的原因。

3.2 5-HT分泌異常引起的臨床表現(xiàn)與IBS肝郁脾虛證十分相似

腦腸肽是腦腸軸與大腦皮層-神經遞質共同分泌的一些神經遞質，具有神經遞質和內分泌激素的雙重身份，同時還承擔著人體的免疫作用，而5-HT則是腦腸肽中非常重要的神經遞質。機體內90%的5-HT由腸嗜鉻細胞（EC細胞）分泌，少量由中樞內5-HT能神經元合成。精神心理因素與5-HT代謝有關，5-HT是重要的神經遞質及神經肽，其代謝的異常與抑郁癥的發(fā)病有著密切關系。人體內部的5-HT，其在中樞水平的改變可導致失眠、焦慮等精神行為異常，在胃腸道可導致腹痛、腹瀉等表現(xiàn)。5-HT分泌釋放引起的臨床表現(xiàn)與我們探討心理狀態(tài)影響腸道疾病相吻合，5-HT通過在中樞的分泌影響機體的心理狀態(tài)，而心理狀態(tài)的改變進而導致胃腸運動的異常。王迎寒等［6］研究發(fā)現(xiàn)，5-HT與IBS肝郁脾虛證候密切相關。趙魯卿等［7］研究也發(fā)現(xiàn)，疏肝健脾方對腹瀉型腸易激綜合征大鼠有較好治療作用，其作用機制可能與降低5-HT的含量有關。所以我們有理由相信，5-HT是IBS肝郁脾虛證關系最為密切的腦腸肽，而痛瀉要方則是通過柔肝和脾的功效來減少機體5-HT的分泌，進而緩解腹痛、腹瀉等腸易激癥狀。

3.3 痛瀉要方通過疏肝、柔肝減少5-HT的分泌從而改善IBS癥狀

從本次的實驗數(shù)據(jù)來看，病理組大鼠血清和結腸的5-HT含量較正常組明顯升高（P＜0.05），而通過低、中、高劑量的痛瀉要方和匹維溴銨治療之后，5-HT含量明顯降低，且高劑量組的5-HT含量與正常組最為相近，說明痛瀉要方和匹維溴銨可通過減少血清和結腸5-HT的含量來減輕IBS的癥狀。但我們前期研究表明［8］，匹維溴銨治療IBS肝郁脾虛證大鼠僅僅緩解了胃腸道的運動異常，對于大鼠由于焦慮、抑郁等表現(xiàn)出的行為學異常沒有明顯的改善，說明匹維溴銨無法緩解大鼠精神情緒的異常，治療效果不如痛瀉要方全面。在中醫(yī)理論中，肝木能夠克脾土，精神情緒的異常對于胃腸道的刺激非常明顯，而匹維溴銨無法緩解精神情緒的異常，只是改善了胃腸道的局部癥狀，無法從根本上治療疾病，這或許是西藥治療后病情易反復的原因。

通過以上分析我們得出結論：痛瀉要方通過疏肝、柔肝的作用，減少大鼠血清和結腸5-HT的含量，進而緩解IBS肝郁脾虛證大鼠的癥狀；匹維溴銨可以減少大鼠血清、結腸5-HT的分泌改善胃腸道動力的異常，但是無法緩解其抑郁、焦慮等心理狀態(tài)。

盡管本實驗證實痛瀉要方治療IBS肝郁脾虛證大鼠與其調節(jié)血清、結腸5-HT的含量有關，但是，由于人體的免疫系統(tǒng)非常強大，簡單的一兩個指標很難對疾病的發(fā)病機制做一個全面的解釋，我們下一步計劃從5-HT的合成酶色氨酸羥化酶（TPH）和重吸收物質5-羥色胺轉運體（SERT）入手，深入全面地探討5-HT信號系統(tǒng)在腸易激綜合征肝郁脾虛證大鼠中的作用。

［1］張璐，段麗萍，劉懿萱，等.中國人群腸易激綜合征患病率和相關危險因素的Meta分析［J］.中華內科雜志，2014，53（14）：969-975.

［2］竇志芳，張俊龍，閆川慧，等.腸易激綜合征用藥規(guī)律研究［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2012，30（2）：387-392.

［3］蔡俊晏.腸易激綜合征（IBS）中醫(yī)藥治療的文獻研究［D］.北京：北京中醫(yī)藥大學，2014.

［4］Wouters M M，Boeckxstaens G E.Neuroimmune mechanisms in functional bowel disorders［J］.Netherlands Journal of Medicine，2011，69（2）：55-61.

［5］尹小君，施茵，趙繼夢.從腦－腸軸角度探討腸易激綜合征及其中醫(yī)治療［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2011，29（10）：2 197-2 201.

［6］王迎寒，劉玉玲，趙素微，等.腹瀉型 IBS 脾虛肝郁證候與 5-HT，CRH 的相關性［J］.中國實驗方劑學雜志，2017，23（18）：124-129.

［7］趙魯卿，張聲生，盧小芳，等.疏肝健脾方對腹瀉型腸易激綜合征大鼠的治療作用及對肥大細胞、5-HT通路的影響［J］.中國中西醫(yī)結合消化雜志，2017，25（8）：589-594.

［8］陳富麗.痛瀉要方治療IBS肝郁脾虛證5-HT與VIP作用機制研究［D］.太原：山西中醫(yī)學院，2016.