王正引，陳 燕，張小如，郭明章

（1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建福州350122； 2.福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，福建福州350122）

中醫(yī)藏象理論認為肝藏血，是指肝對血液有貯藏，調(diào)節(jié)及收攝作用。李梴《醫(yī)學入門》曰：“人身動則血行于諸經(jīng)，靜則藏于肝臟，故肝為血海。”肝血充盈，則臟腑官竅得濡，肌肉毛發(fā)可養(yǎng)。肝藏血功能失調(diào)，則營血虛損，機體失于濡養(yǎng)，是造成血虛證的主要原因之一。四物湯由熟地、當歸、白芍及川芎組成，此四味藥均歸肝經(jīng)，功可補血養(yǎng)肝，用于治療血虛證。本課題組為了探討四物湯補血養(yǎng)肝的作用機制，在前期研究中發(fā)現(xiàn)四物湯可減少血虛證小鼠肝細胞凋亡［1］，下調(diào)血虛證小鼠促凋亡基因Bax、Fas mRNA表達［2-3］。半胱天冬氨酸蛋白酶（Cysteinyl aspartate-specific protease，Caspase）是凋亡信號傳遞的交匯節(jié)點。Caspase8作為凋亡信號通路下游的關鍵分子，是細胞凋亡的啟動者［4］。本研究通過觀察四物湯對血虛證小鼠肝細胞凋亡啟動分子Caspase8 mRNA表達的影響，進一步探討其對血虛證模型肝細胞凋亡影響的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/6J小鼠，清潔級，8 w齡，24 只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，上海斯萊克實驗動物有限公司提供［動物許可證號：SCK（滬）2012-0002］。

1.1.2 藥物及制備 四物湯按《方劑學》教材［5］規(guī)定的劑量稱取，熟地15 g，當歸9 g，白芍9 g，川芎6 g，按傳統(tǒng)方法水煎，煎煮兩次，取兩次水煎液合并后濃縮，每mL藥液含生藥量約0.25 g，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑與儀器 注射用環(huán)磷酰胺（通化茂祥制藥有限公司，批號：120801）；Trizol（大連寶生物工程有限公司）；2×SYBR real-time PCR premixture、cDNA第一條鏈合成試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）；TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（瑞士Roche公司）；XT2000iv全自動血液分析儀（日本Sysmex公司）；DYCP-31DN電泳儀（北京六一儀器廠）；ABI7500熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；5417R低溫離心機（德國Eppendorf公司）；GDS-8000凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及造模 24只C57BL/6J小鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為3組，每組8只，分別為空白組、模型組、給藥組。小鼠常規(guī)飼養(yǎng)1 w適應環(huán)境后，參照化學損傷法［6］造模，模型組、給藥組于實驗第1 d按小鼠體質(zhì)量0.1 g/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺1次，環(huán)磷酰胺作為細胞周期非特異性細胞毒藥物，可抑制骨髓造血，從而建立血虛模型?？瞻捉M予等體積生理鹽水腹腔注射。

1.2.2 動物給藥 按人與小鼠體表面積折算的等效劑量比計算小鼠給藥劑量［7］，給藥組予四物湯按5 g/（kg·d）劑量灌胃。每日1次，連續(xù)灌胃7 d?？瞻捉M和模型組則給予等體積的生理鹽水。

1.2.3 外周血象檢測 在實驗第7 d，給藥1 h后，每只小鼠眼眶后靜脈叢取血約0.1 mL，以全自動血液分析儀檢測外周血紅細胞數(shù)、白細胞數(shù)、血小板數(shù)及血紅蛋白含量。

1.2.4 肝細胞凋亡檢測 在實驗第8 d，頸椎脫臼處死小鼠，剖腹取肝臟，4℃預冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干，肝右前葉切取1.0 cm×1.0 cm×1.0cm組織塊，10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，以TUNEL試劑盒檢測肝細胞凋亡百分率。

1.2.5 Caspase8 mRNA表達的熒光定量PCR檢測 按Trizol法提取總RNA。參照cDNA第一條鏈合成試劑盒說明書逆轉錄cDNA。 根據(jù)Genebank基因序列設計引物，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR的引物序列

PCR反應體系如下：引物1 μL、cDNA模板2 μL 、ddH2O 7 μL、2×SYBR premixture 10 μL，總體積 20 μL，反應條件為95℃預變性2 min，95℃變性 20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，反應40個循環(huán)。循環(huán)結束后，72℃延伸2 min。

記錄樣本Ct（Cycle threshold）值，參照2-△△Ct法［8］，以 2-△△Ct比較各組 Caspase8 的 mRNA 表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠外周血象的比較

各組小鼠外周血紅細胞數(shù)、白細胞數(shù)、血小板數(shù)及血紅蛋白含量經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗及Levene檢驗，統(tǒng)計結果表明數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊同。單因素方差分析結果表明，紅細胞數(shù)及血紅蛋白含量總體均數(shù)不全相等（P＜0.01）。白細胞數(shù)及血小板數(shù)各組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與空白組相比，模型組外周血紅細胞數(shù)、血紅蛋白含量降低（P＜0.01）。與模型組相比，給藥組外周血紅細胞數(shù)、血紅蛋白含量升高（P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組小鼠外周血象比較 （±s）

表2 各組小鼠外周血象比較 （±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

組別 n 紅細胞（1 0 12/L） 白細胞（1 0 9/L） 血小板（1 0 9/L） 血紅蛋白（g/L）空白組 8 9.9 3±0.7 5 6.3 1±1.4 9 1 0 1 5.5 0±2 5 4.0 6 1 5 0.7 5±1 1.5 4模型組 8 7.4 5±0.6 4 1） 4.8 8±1.3 1 1 1 2 9.6 3±2 4 1.0 8 1 1 8.7 5±6.9 0 1）給藥組 8 8.5 2±0.4 3 2） 6.7 4±1.9 4 1 1 6 5.8 8±2 6 1.7 6 1 3 2.1 3±6.2 7 2）F值 3 2.0 7 2.9 7 0.7 7 2 8.1 8 P值 ＜0.0 1 0.0 7 0.4 7 ＜0.0 1

2.2 各組小鼠肝細胞凋亡百分率的比較

各組小鼠肝細胞凋亡百分率、Caspase8 mRNA 2-△△Ct經(jīng) Shapiro-Wilk 檢驗及 Levene 檢驗，統(tǒng)計結果表明數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差不齊。再運用Nemenyi法進行非參數(shù)秩和檢驗比較各組間差異，自由度v=2，與空白組相比，模型組肝細胞凋亡百分率上升（χ2=11.58，P＜0.05），Caspase8 mRNA 2-△△Ct升高（χ2=11.96，P＜0.05）。與模型組相比，給藥組肝細胞凋亡百分率下降（χ2=11.58，P＜0.05），Caspase8 mRNA 2-△△Ct降低（χ2=11.96，P＜0.05）。結果見表3。

表3 各組小鼠肝細胞凋亡百分率、Caspase8 mRNA表達比較

3 討論

對于四物湯的作用機制研究，主要集中從免疫功能、骨髓造血功能等方面來探討。近年來已有研究報道，慢性支氣管炎肺氣虛證大鼠肺實質(zhì)細胞凋亡率升高［10］，慢性淺表性胃炎脾虛證大鼠胃黏膜細胞凋亡指數(shù)上升［11］。表明中醫(yī)八綱辨證中的虛證與細胞凋亡存在相關性。因此本研究在肝藏血理論指導下，從細胞凋亡水平探討四物湯補血養(yǎng)肝作用機制。結果表明四物湯可升高血虛證小鼠外周血紅細胞數(shù)及血紅蛋白含量，減少血虛證小鼠模型肝細胞凋亡，與前期研究結果一致。

而在細胞凋亡的信號傳導通路中，Caspase8處于凋亡有序級聯(lián)反應的下游，是關鍵的凋亡啟動分子。在Fas所介導的外源性凋亡途徑中，當細胞膜表面的Fas受體與其配體FasL結合后，F(xiàn)as受體發(fā)生多聚化，使Caspase8激活，再作用于胞漿中其他Caspases，使它們發(fā)生逐級活化，引發(fā)Caspases級聯(lián)反應。激活的Caspase8還可啟動內(nèi)源性凋亡途徑。Caspase8在胞漿中裂解Bcl-2家族成員BH3結構域凋亡誘導蛋白，誘導線粒體釋放細胞色素C，進一步誘發(fā)Caspases級聯(lián)反應。使外源性途徑與內(nèi)源性途徑互相聯(lián)系起來，放大凋亡信號，加速細胞凋亡［12］。

在前期研究中，本課題組探討了四物湯對血虛證小鼠肝細胞凋亡信號傳導通路上游調(diào)控基因表達的影響，本研究進一步探討其對該通路下游調(diào)控分子Caspase8 mRNA表達的影響。由于沒有已知起始拷貝數(shù)的Caspase8標準品，因此本研究采用相對定量的2-△△Ct法比較各組的mRNA表達水平。以GAPDH為內(nèi)參照基因，待測目的基因為Caspase8，記錄樣本Ct值，計算2-△△Ct，其數(shù)值表示各組目的基因拷貝數(shù)是空白組的 2-△△Ct倍，以 2-△△Ct代表各組的mRNA相對表達量。本研究結果表明，四物湯可降低 Caspase8 mRNA 2-△△Ct，下調(diào) Caspase8 mRNA表達水平。提示四物湯減少血虛證小鼠肝細胞凋亡，作用機制可能與其抑制Caspase8激活有關。

［1］王正引，張小如，郭明章，等.補血養(yǎng)肝法對血虛證小鼠肝細胞凋亡的影響［J］.山西中醫(yī)學院學報，2014，15（2）：11-13.

［2］王正引，郭明章，全世建.四物湯對血虛證小鼠肝細胞凋亡以及凋亡相關基因表達的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（6）：2 219-2 222.

［3］王正引，全世建，郭明章，等.四物湯對血虛證小鼠肝細胞凋亡以及Bax表達的影響［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報2014，16（10）：28-30.

［4］Algeciras-Schimnich A，Barnhart B C，Peter M E.Apoptosis-independent functions of killer caspases［J］.Curr Opin Cell Biol，2002，14（6）：721-726.

［5］李冀.方劑學［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2006：176.

［6］楊嵐，祝彼得，彭成.血虛證動物模型的標準化研究初探［J］.實驗動物科學與管理，2006，23（1）：5-9.

［7］陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：1 169.

［8］王琰，徐瑞榮，崔思遠，等.端粒保護蛋白1在不同證型獲得性再生障礙性貧血患者中的表達及相關性研究［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2013，20（8）：18-20，35.

［9］劉偉，林漢生.SPSS在完全隨機設計多個樣本間多重比較Nemenyi秩和檢驗中的應用［J］.中國衛(wèi)生統(tǒng)計，2009，26（2）：214，216.

［10］姚寶林，楊麗蕓，趙靜，等.補氣活血方對慢性支氣管炎肺氣虛證大鼠肺組織細胞凋亡的影響［J］.解放軍醫(yī)藥雜志，2014，26（6）：81-84.

［11］王麗，王垂杰，孫曉婷.慢性淺表性胃炎大鼠胃黏膜細胞凋亡與中醫(yī)證型的相關性［J］.環(huán)球中醫(yī)藥，2013，6（6）：401-404.

［12］Cepero E，King A M，Coffey L M，et al.Caspase-9 and effector caspases have sequential and distinct effects on mitochondria［J］.Oncogene，2005，24（42）：6 354-6 366.