朱懷嬌，韓燕禎，杜鵬男，康 凱，畢思遠，徐向東*

(1.河北醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院，河北 石家莊 050017；2.深圳市易瑞生物技術有公司，廣東 深圳 518101)

嗎啡(Morphine,MOP)是由阿片提煉的一種阿片生物堿，為純粹的阿片受體激動劑，具有顯著的鎮(zhèn)痛作用。作為麻醉性鎮(zhèn)痛藥，嗎啡在使用初期有欣快感和夢幻現(xiàn)象，極易產生耐受性和成癮，是阿片類毒品的重要組成之一，也是其它阿片類毒品如海洛因、可待因等在體內的最終代謝產物[1-2]。以海洛因為例，其進入人體后很快代謝為單乙酰嗎啡，進而代謝為嗎啡[3-4]。因此，尿液及血液中嗎啡含量的測定，對法醫(yī)鑒定、法醫(yī)毒物分析以及毒品濫用證據(jù)的提供均具有重要意義。

由于時效性，法醫(yī)鑒定所用的血液或尿液樣品往往不易重復獲得，樣本量有限，因此與常規(guī)檢測相比，對檢測方法的靈敏度和樣品消耗量有更高要求。目前,嗎啡的測定方法主要有薄層色譜掃描法[5]、氣相色譜法[6]、氣相色譜-質譜聯(lián)用法[7-8]、高效液相色譜法[9]、高效液相色譜-質譜聯(lián)用法[10-11]、毛細管電泳法[12]、化學發(fā)光法[13]等。毛細管電泳分離技術具有分離效率高、分離速度快、樣品消耗量小的特點，應用于毒品的分離分析有獨特優(yōu)勢[14]?；瘜W發(fā)光檢測方法應用于毛細管電泳是一種非常理想的檢測手段。相對于紫外可見分光光度法、熒光法等檢測方法，化學發(fā)光無需激發(fā)光，避免了瑞利散射和拉曼散射等噪音，因而儀器簡單，且提高了信噪比，具有靈敏度高的特點。與單純使用化學發(fā)光檢測技術相比，毛細管電泳-化學發(fā)光聯(lián)用可實現(xiàn)高選擇性與高靈敏度的結合。二者的聯(lián)用技術已成為分析化學領域的研究熱點之一[15]，目前尚未見毛細管電泳-化學發(fā)光法用于嗎啡檢測的報道。

探索新的化學發(fā)光體系對于擴大化學發(fā)光檢測技術的應用范圍具有重要意義。Ag(Ⅲ)-魯米諾化學發(fā)光體系具有反應速度快、氧化電位高、發(fā)光量子產率高等特點[16]。研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡在堿性條件下可抑制Ag(Ⅲ)-魯米諾化學發(fā)光體系的發(fā)光強度，且在一定范圍內，其抑制程度與嗎啡含量呈現(xiàn)良好的線性關系?；诖?，利用自制的毛細管電泳-化學發(fā)光檢測儀，建立了毛細管電泳-間接化學發(fā)光檢測體液中嗎啡含量的方法。該方法應用于尿樣與血樣中嗎啡含量的測定，結果滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

圖1 毛細管電泳-化學發(fā)光檢測儀裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of apparatus for the capillary electrophoresis-chemiluminescence detector

石英毛細管(河北永年縣銳灃色譜器件有限公司)；高壓電源(北京安和光電儀器有限責任公司)；光電倍增管(北京濱松光子技術有限公司)；千譜色譜工作站(上海千譜軟件有限公司)；電子天平(丹佛儀器(北京)有限公司)。實驗所用毛細管電泳-化學發(fā)光檢測儀為自組裝(圖1)，與文獻[16]相同。將長度75 cm的電泳毛細管(內徑50 μm)一端(長約8 cm)經(jīng)氫氟酸刻蝕50 min后，將8 cm長的刻蝕段插入反應管(內徑530 μm)中。將反應管中1 cm段燒去聚酰亞胺涂層作檢測窗(電泳分離管的末端插入其中)。一根試劑引入管(內徑200 μm)以重力方式引入氧化試劑，試劑池距緩沖液蓄池高20 cm。三根毛細管用三通接頭固定。其中反應毛細管位置固定后，使檢測窗正位于光電倍增管前。反應系統(tǒng)和光電倍增管置于密封的暗箱中。由光電倍增管收集化學發(fā)光信號，色譜工作站處理數(shù)據(jù)，以遷移時間定性，以峰高定量。

嗎啡標準物質(中國食品藥品檢定研究院)；魯米諾(東京化成工業(yè)株式會社)；氫氧化鈉、四硼酸鈉、磷酸二氫鈉、AgNO3、KIO4、K2S2O8、KOH均為國產分析純，實驗用水為雙蒸水。嗎啡標準儲備液(500 mg/L)：準確稱取嗎啡標準品5.0 mg于容量瓶中，用50%甲醇定容至10 mL，避光于4 ℃冰箱保存；魯米諾儲備液(20 mmol/L)：準確稱取0.354 4 g魯米諾，加入2.80 mL 1.0 mol/L NaOH，加水定容至100 mL，避光保存；硼砂儲備液(50 mmol/L)：準確稱取4.767 3 g四硼酸鈉溶于水，加熱溶解后冷卻，定容至250 mL。Ag(Ⅲ)配合物儲備液：配制方法同文獻[17]。

1.2 實驗方法

1.2.1儀器條件新毛細管依次用1 mol/L NaOH沖洗20 min，0.1 mol/L HCl和雙蒸水各沖洗10 min。每次實驗前依次進行常規(guī)操作：分離管分別用0.1 mol/L NaOH與雙蒸水各沖洗10 min，再用緩沖液平衡30 min后進樣檢測。

1.2.2樣品處理方法尿樣處理：取OASIS?HLB(6 mL/200 mg)固相萃取柱，依次用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL磷酸鹽緩沖溶液進行活化，加入2 mL尿樣；用1 mL 0.1 mol/L HCl、1 mL H2O、1.5 mL 0.15 mol/L碳酸銨溶液依次淋洗柱子后，將柱子抽真空5 min除去殘余水分；隨后用3 mL 5%氨水/甲醇洗脫，收集洗脫液在60 ℃下氮氣吹干，用1 mL水復溶待測。

血樣處理：取1.5 mL血樣以11 000 r/min離心15 min，取上清液加入等體積的0.2 mol/L pH 4.6磷酸鹽緩沖溶液，混勻。取OASIS?HLB(6 mL/200 mg)固相萃取柱，依次用3 mL甲醇、3 mL水活化柱子，加入血樣，用3 mL水淋洗柱子后將柱抽真空5 min除去殘留水分，隨后用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液經(jīng)氮氣吹干后，用1 mL水復溶待測。

2 結果與討論

2.1 化學發(fā)光條件的選擇

2.1.1Ag(Ⅲ)溶液堿度的選擇pH值是影響化學發(fā)光的重要因素。為避免空氣中二氧化碳對堿液的影響，實驗采用NaOH-Na2CO3混合緩沖溶液調節(jié)Ag(Ⅲ)溶液的堿度。分別考察了NaOH濃度為0.01～0.05 mol/L和Na2CO3濃度為0.005～0.010 mol/L時對化學發(fā)光信號強度的影響。結果表明，NaOH為0.04 mol/L、Na2CO3為0.008 mol/L時，化學發(fā)光強度最大，且信號穩(wěn)定。故將Ag(Ⅲ)溶液中NaOH濃度定為0.04 mol/L、Na2CO3濃度定為0.008 mol/L。

2.1.2Ag(Ⅲ)溶液濃度的選擇實驗考察了Ag(Ⅲ)溶液濃度為4.0×10-5～9.0×10-5mol/L時對發(fā)光體系的影響。結果表明，隨著Ag(Ⅲ)溶液濃度的增大，發(fā)光強度隨之增大。當Ag(Ⅲ)溶液濃度為7.0×10-5mol/L時，化學發(fā)光強度最大，且信號穩(wěn)定。繼續(xù)增大Ag(Ⅲ)溶液濃度時發(fā)光強度反而降低，這可能是由于高濃度溶液會部分吸收發(fā)光信號所致。故Ag(Ⅲ)溶液濃度定為7.0×10-5mol/L。

2.1.3魯米諾濃度的選擇實驗考察了魯米諾濃度在0.001～0.004 mol/L范圍內對化學發(fā)光信號的影響。結果顯示，當魯米諾濃度為0.002 mol/L時，發(fā)光強度達到最大，繼續(xù)增加魯米諾濃度對提高化學發(fā)光強度并無顯著效果。故魯米諾溶液濃度定為0.002 mol/L。

2.2 電泳條件的選擇

2.2.1硼砂緩沖溶液的選擇實驗在0.002～0.015 mol/L范圍內對硼砂濃度進行優(yōu)化。結果表明，硼砂濃度為0.005 mol/L時化學發(fā)光信號達到最大值，隨后逐漸減小。故將硼砂濃度定為0.005 mol/L。

2.2.2分離電壓的選擇毛細管電泳分離電壓不僅能影響遷移速度與分離效果，還會影響化學發(fā)光信號。電壓過低，電泳速度較慢，峰形展寬。電壓過高，電泳速度加快，但產生的焦耳熱相應增加，易導致峰形展寬、分離效率下降[18]。實驗考察了分離電壓在5～18 kV范圍內對化學發(fā)光信號和分離效果的影響。結果表明，分離電壓為15 kV時，化學發(fā)光信號最大，分離效果較好，故將分離電壓定為15 kV。

2.2.3進樣時間的選擇固定發(fā)光條件與其他電泳條件，采用重力進樣方式，考察了進樣時間在4～15 s范圍內時對化學發(fā)光強度的影響。結果表明，進樣時間為12 s時，化學發(fā)光強度達最大，且峰形尖銳，分離效果佳，故確定最佳進樣時間為12 s。

綜上，確定最佳檢測條件為：Ag(Ⅲ)溶液濃度7.0×10-5mol/L，NaOH濃度0.04 mol/L、Na2CO3濃度0.008 mol/L、魯米諾濃度0.002 mol/L、硼砂濃度0.005 mol/L、分離電壓15 kV、進樣時間12 s。

2.3 工作曲線、檢出限與精密度

取嗎啡標準儲備液，用雙蒸水稀釋后得到一系列質量濃度分別為2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 mg/L的標準工作溶液。在上述選定的最佳實驗條件下，分別進樣，得到不同質量濃度嗎啡溶液的色譜圖。以峰高值(Y)對嗎啡質量濃度(X,mg/L)作圖，得到線性回歸方程為Y=3.826 5X+14.14(r=0.999 8)。結果表明，嗎啡質量濃度在2.0～30.0 mg/L范圍內線性良好,方法檢出限(S/N=3)為0.75 mg/L。取20.0 mg/L嗎啡進行7次平行實驗，測得相對標準偏差(RSD)為2.0%。

2.4 樣品回收率測定

取嗎啡標準儲備液加入2 mL空白尿樣中，旋渦混勻2 min，冷藏40 min后以3 500 r/min離心5 min。取上清液1 mL，加入1 mL 0.2 mol/L pH 4.6磷酸鹽緩沖溶液，混勻。制成3、8、20 mg/L 3個質量濃度的待測加標尿樣。再取嗎啡標準儲備液加入到1.5 mL空白血樣中，旋渦混勻3 min，冷藏40 min后于37 ℃ 11 000 r/min離心15 min。取上清液700 μL加入等體積的0.2 mol/L pH 4.6磷酸鹽緩沖溶液，混勻，制備成3、8、20 mg/L 3個質量濃度的待測加標血樣。

尿液與血液樣品檢測結果見圖2。由圖可見，嗎啡在9 min內即可實現(xiàn)分離分析，尿液與血液中的其他物質對檢測無干擾。利用相對峰高值定量，測得尿樣與血樣中嗎啡的平均回收率分別為109.0%與101.3%(表1)。

SampleAdded(mg/L)Measured(mg/L)Recovery(%)Averagerecovery(%)Urine33.06102.0109.088.92111.52022.72113.6Blood32.5284.0101.388.58107.22022.52112.6

3 結 論

本研究基于一種新的化學發(fā)光體系(Ag(Ⅲ)配合物-魯米諾化學發(fā)光體系)，將毛細管電泳技術與之聯(lián)用，建立了毛細管電泳-間接化學發(fā)光法用于尿樣與血樣中嗎啡含量的檢測。該方法結合固相萃取前處理技術，操作簡便、靈敏度高、分辨率高、對環(huán)境友好且分析成本低，為生物樣品中嗎啡的含量測定提供了一種快速、有效的新方法。

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