呂菊波，張亞會，孟凡斌，劉 剛，徐 慧

(魯東大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院, 山東 煙臺 264025)

鉛離子是一種常見的重金屬離子，主要用于鉛酸蓄電池、電纜和化工行業(yè)。鉛離子可以通過生物富集作用被人體吸收，極少量的鉛離子就會對人體健康和生物環(huán)境產(chǎn)生極大的危害[1-4]。所以尋求新的技術(shù)有效檢測鉛離子對于人類的健康和環(huán)境的保護(hù)顯得十分重要。

目前常見的鉛離子的檢測方法主要有物理化學(xué)方法和生物傳感器法等，物理化學(xué)方法主要有原子吸收光譜(AAS)[5-7]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-AES)[8-10]、陽極溶出伏安法(ASV)[11-13]、X射線熒光光譜法[14]等，這些方法操作要求高、儀器昂貴、對鉛離子的檢測不夠敏感，不能滿足較低濃度鉛離子的檢測需求。生物傳感器法是通過生物分子與金屬離子之間的特異性結(jié)合，定性、定量檢測金屬離子的方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測快速等優(yōu)點(diǎn)。

功能核酸是一類具有特定生物功能的核酸分子，包括核酸適配體(Aptamer)[15-17]、脫氧核酶DNA酶[18-20]和蛋白酶[21]等，其功能遠(yuǎn)超出傳統(tǒng)核酸的遺傳作用。近年來功能核酸已被廣泛應(yīng)用于生物傳感等研究領(lǐng)域，并對蛋白質(zhì)、金屬離子以及小分子等進(jìn)行檢測[22-25]。

1990年，核酸適配體首次被報道[26-27]之后，即被廣泛應(yīng)用在分析檢測、分離、醫(yī)療診斷和生物成像等領(lǐng)域。Taghdisi等[28]基于熒光標(biāo)記的鉛離子核酸適配體和單壁碳納米管(SWCNT)的超猝滅效應(yīng)發(fā)展了一種超靈敏檢測鉛離子的方法。無鉛離子存在時，熒光標(biāo)記的核酸適配體吸附到SWCNT表面，熒光被猝滅。加入鉛離子后，核酸適配體與鉛離子結(jié)合，形成G-四面體/Pb2+復(fù)合物，不被SWCNT吸附，熒光增強(qiáng)。該傳感器對Pb2+有很高的選擇性，檢出限達(dá)0.42 nmol/L。Lu等[29]發(fā)展了一種利用共軛高分子和核酸適配體高靈敏度檢測鉛離子的方法，當(dāng)鉛離子存在時，將誘導(dǎo)其特異性DNA形成四面體結(jié)構(gòu)，共軛高分子纏繞在四面體上，溶液顏色由紅色變成黃色，并且其最大吸收峰和熒光峰發(fā)生藍(lán)移。用此方法肉眼可辨別出2 μmol/L的Pb2+。

此外，依賴Pb2+的DNA酶已廣泛應(yīng)用于Pb2+的檢測，Li和Lu[30]設(shè)計了一種基于鉛離子的8-17 DNA酶的熒光傳感器檢測鉛離子。該傳感策略在10 nmol/L～4 μmol/L內(nèi)具有較好的動力學(xué)范圍，在4 ℃下具有良好的選擇性，但室溫下背景熒光較高。為克服這個缺點(diǎn)，在基底DNA鏈的3＇端引入分子內(nèi)猝滅劑，可在室溫下抑制背景熒光[31]，除此之外，在8-17 DNA酶中引入錯配防止溫度引起的變化[32]，使用GR-5 DNA酶代替8-17 DNA酶[33]，可以獲得更好的選擇性。而將基于鉛離子的8-17 DNA酶的基底DNA鏈設(shè)計成分子信標(biāo)，可以有效猝滅熒光強(qiáng)度[34]，當(dāng)存在鉛離子時，分子信標(biāo)的環(huán)部分可被8-17 DNA酶裂解，熒光基團(tuán)與猝滅劑分離，熒光增強(qiáng)，檢出限達(dá)到0.6 nmol/L。Guo等[35]設(shè)計了一種能同時檢測汞離子、鉛離子和銅離子的生物傳感方法，將這3種金屬離子分別加入到木瓜酶包裹的納米金溶液中，三者與木瓜酶結(jié)合，使納米金聚集，溶液的顏色由酒紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色。且汞離子與木瓜酶結(jié)合能力較強(qiáng)，溶液顏色變化更加明顯，具有較好的選擇性，檢測限為200 μmol/L。

上述方法大多需熒光標(biāo)記、合成高分子、納米材料輔助檢測或操作繁瑣，因此亟需發(fā)展簡單、快速、免標(biāo)記且高靈敏度的檢測鉛離子的傳感方法。本文基于DNA雙鏈取代的策略，首先，適配體與其互補(bǔ)鏈結(jié)合形成穩(wěn)定的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，無Pb2+時，向溶液中加入SYBR Green I(SG)，SG能夠插入雙鏈DNA，使熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；當(dāng)溶液中加入鉛離子后，鉛離子與適配體特異性結(jié)合，并形成穩(wěn)定的G-四面體結(jié)構(gòu)，雙鏈結(jié)構(gòu)被打開。鉛離子的加入使溶液中雙鏈DNA的數(shù)量減少，體系的熒光強(qiáng)度降低，因而可以定量檢測鉛離子。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

鉛離子特異性DNA(Pb aptamer)、其部分互補(bǔ)鏈DNA(com)、另一對完全互補(bǔ)的單鏈DNA1和DNA2，所有DNA均由Takara公司合成并經(jīng)高效液相色譜(HPLC)純化，所用DNA序列有：Pb aptamer：(5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’)；com：(5’-CACCCTCCCAC-3’)；DNA1：(5’-CCG TCA GAA GTT CCT TTG CCG(A)9-3’)；DNA2：(5’-CGG CAA AGG AAC TTC TGA CGG TTCC-3’)。Sybr Green Ⅰ購于Inviotrogen公司，母液濃度為10 000×(19.6 mmol/L)[36]，使用時用二甲亞砜(DMSO)稀釋至所需濃度。Pb2+、K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+、Hg2+的水溶液由其硝酸鹽配制，所有溶液均用18.25 MΩ·cm的超純水配制而成。二甲亞砜(國藥化學(xué)試劑有限公司)，所有試劑均為分析純。雜交緩沖液(雜交Buffer)：10 mmol/L Tris-HAc(0.2 mol/L NaAc)，pH 7.5。

LS-55熒光分光光度計(美國Perkins Elmer儀器有限公司)測試條件為：脈沖式氙燈激發(fā)，激發(fā)波長為490 nm，熒光光譜的掃描范圍為495～600 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為8 nm，用寬度10 mm石英比色皿進(jìn)行測量，樣品體積2 mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1SG濃度的優(yōu)化通過改變?nèi)玖蠅A基對比例(即染料與堿基對的比值dbpr)，進(jìn)行染料用量優(yōu)化。首先固定DNA的濃度為20 nmol/L，改變?nèi)玖系臐舛?，其中dbpr分別為0.1、0.3、0.57、0.9、1.2，通過檢測加入終濃度為500 nmol/L鉛離子前后熒光強(qiáng)度的變化，確定最佳染料濃度。

1.2.2反應(yīng)時間的優(yōu)化在2 mL雜交Buffer體系中加入20 μL 2 μmol/L Pb aptamer和com，兩DNA終濃度為20 nmol/L，混合均勻，32 ℃反應(yīng)30 min。然后加入10 μL 20 μmol/L的鉛離子，終濃度為100 nmol/L，32 ℃反應(yīng)不同時間。按照dbpr為0.57加入23.26 μL 的9.8 μmol/L SG，反應(yīng)5 min，測定熒光強(qiáng)度。

1.2.3最佳pH值與離子強(qiáng)度的優(yōu)化在2 mL不同pH值的雜交Buffer(pH 7.3、7.5、7.8、8.0)或10 mmol/L Tris-HAc(含不同NaAc)的雜交Buffer中，加入20 μL 2 μmol/L Pb aptamer和com，兩DNA終濃度為20 nmol/L，混合均勻，32 ℃反應(yīng)30 min。然后加入10 μL 100 μmol/L的鉛離子，終濃度為500 nmol/L，32 ℃反應(yīng)不同時間。按照dbpr為0.57加入23.26 μL 的9.8 μmol/L SG，反應(yīng)5 min，測定熒光強(qiáng)度。

1.2.4靈敏度分析在2 mL 雜交Buffer體系中加入20 μL 2 μmol/L Pb aptamer和com，兩DNA終濃度為20 nmol/L，混合均勻，在32 ℃下反應(yīng)30 min。加入不同濃度的鉛離子，32 ℃下反應(yīng)2 h。按照dbpr為0.57加入23.26 μL 的9.8 μmol/L SG，反應(yīng)5 min，測定熒光強(qiáng)度。

1.2.5鉛離子對SG熒光強(qiáng)度的影響在2 mL 雜交Buffer體系中加入10 μL 4 μmol/L DNA1和DNA2，兩DNA終濃度為20 nmol/L，混合均勻，32 ℃反應(yīng)30 min。加入不同濃度的鉛離子，32 ℃反應(yīng)2 h，按照dbpr為0.57加入9.77 μL 的49.0 μmol/L SG，反應(yīng)5 min，測定熒光強(qiáng)度。

1.2.6選擇性實(shí)驗(yàn)在2 mL 雜交Buffer體系中加入20 μL 2 μmol/L Pb aptamer和com，兩DNA終濃度為20 nmol/L，混合均勻，32 ℃反應(yīng)30 min。加入10 μL 100 μmol/L終濃度為500 nmol/L的不同金屬離子，32 ℃反應(yīng)2 h。按照dbpr為0.57加入23.26 μL 9.8 μmol/L SG，反應(yīng)5 min，測定熒光強(qiáng)度。

以上所有實(shí)驗(yàn)平行3組，作誤差棒分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

圖1 鉛離子檢測原理Fig.1 Principle for detection of lead ion

本實(shí)驗(yàn)基于DNA雙鏈取代的策略，核酸適配體可以與靶向分子特異性結(jié)合，改變適配體的構(gòu)象，而熒光染料SG能夠插入雙鏈DNA使其熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，基于此設(shè)計了一種檢測鉛離子的生物傳感策略，檢測原理如圖1所示。鉛離子適配體首先與其互補(bǔ)鏈雜交形成穩(wěn)定的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，此時溶液中無Pb2+，向溶液中加入SG，SG能夠插入雙鏈DNA使SG的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，此時體系的熒光強(qiáng)度較高。當(dāng)溶液中加入鉛離子時，鉛離子與其適配體特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的G-四面體DNA結(jié)構(gòu)，雙鏈結(jié)構(gòu)被打開，雙鏈數(shù)量減少，體系的熒光強(qiáng)度降低，熒光強(qiáng)度的降低量與鉛離子的加入量相關(guān)，因此，這種方法可用以定性、定量檢測鉛離子，且方法簡單快速，無需熒光標(biāo)記DNA。

2.2 SG濃度的優(yōu)化

SG能夠插入雙鏈DNA使其熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，若SG用量太少則不能完全插入雙鏈DNA，而用量太多又會使多余的SG游離在溶液中，增強(qiáng)檢測的背景熒光，因此選擇合適的SG用量對生物傳感器的研究相當(dāng)重要。實(shí)驗(yàn)通過不同的染料堿基對比例(dbpr)與加入鉛離子前后熒光強(qiáng)度比值(F0/F)的關(guān)系對SG濃度進(jìn)行優(yōu)化。dbpr分別為0.1、0.3、0.57、0.9、1.2，F(xiàn)0表示未加鉛離子時的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)表示加入鉛離子時的熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，隨著dbpr的增加，F(xiàn)0/F呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)dbpr為0.57時F0/F最大，說明此時SG的用量最佳，因此選擇dbpr為0.57，即加入23.26 μL 的9.8 μmol/L SG。

2.3 反應(yīng)時間的優(yōu)化

固定鉛離子的終濃度為100 nmol/L，考察了不同的反應(yīng)時間(0、1、3、5、10 min)條件下體系的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時間的增加，體系的熒光強(qiáng)度逐漸降低，并在反應(yīng)0～1 min時降幅最大，當(dāng)反應(yīng)時間為5 min時體系的熒光強(qiáng)度趨于平穩(wěn)。因此，鉛離子的最佳反應(yīng)時間為5 min。

2.4 pH值與離子強(qiáng)度的優(yōu)化

溶液的pH值和離子強(qiáng)度會影響DNA的雜交、反應(yīng)動力學(xué)和SG的熒光強(qiáng)度，因此實(shí)驗(yàn)考察了pH值和離子強(qiáng)度的影響。F0表示未加Pb2+時的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)表示加入500 nmol/L Pb2+時的熒光強(qiáng)度。F0/F在生理pH值(7.3～8.0)附近改變很小，因此選擇pH 7.5為反應(yīng)的最佳酸度。此外，F(xiàn)0/F隨NaAc濃度的增加而增加，當(dāng)NaAc濃度大于0.2 mol/L后F0/F保持不變。因此，最佳離子強(qiáng)度為0.2 mol/L NaAc。

2.5 靈敏度分析

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，通過檢測體系中熒光強(qiáng)度隨鉛離子濃度的變化，得到熒光強(qiáng)度與鉛離子濃度變化的光譜圖和關(guān)系圖(圖2)。由圖2可見，隨著鉛離子濃度的不斷增加，體系的熒光強(qiáng)度不斷減小。這是由于隨著鉛離子的不斷加入，鉛離子與其適配體特異性結(jié)合，雙鏈DNA數(shù)量減少，而SG從雙鏈DNA上釋放出來，體系的熒光強(qiáng)度減弱。

圖2 不同濃度鉛離子存在時的熒光光譜圖(A)以及鉛離子濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系(B)Fig.2 The fluorescence spectra of different concentrations of Pb2+(A) and the relationship between Pb2+ concentration and fluorescence intensity(B)1-14:0,2,5,20,50,70,100,200,300,400,500,1 000,2 000,5 000 nmol/L

分析發(fā)現(xiàn)體系的熒光強(qiáng)度(Y)與鉛離子濃度(X,nmoI/L)之間呈良好的線性關(guān)系。其中，當(dāng)鉛離子濃度為2～100 nmol/L時，線性方程為Y=83.22-0.26X，r2=0.991 4；當(dāng)鉛離子濃度為100～500 nmol/L時，線性方程為Y=60.80-0.03X，r2=0.969 2。結(jié)果顯示，該方法可以用于鉛離子的定量檢測，檢出限(S/N=3)為1.6 nmol/L。

2.6 鉛離子對SG熒光的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)計了1對與鉛離子不能結(jié)合的兩條互補(bǔ)鏈DNA分別取代Pb aptamer和com，通過加入不同量的鉛離子和SG檢測體系的熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，隨著鉛離子的不斷增加，體系的熒光強(qiáng)度基本保持不變。其中DNA1和DNA2是完全互補(bǔ)的兩條單鏈DNA，鉛離子不能與任何一條單鏈DNA作用打開雙鏈DNA，說明鉛離子對SG的熒光強(qiáng)度不會產(chǎn)生猝滅作用，而本實(shí)驗(yàn)熒光強(qiáng)度的降低是由于鉛離子與其適配體結(jié)合打開雙鏈DNA，使體系熒光強(qiáng)度降低，鉛離子對SG的熒光強(qiáng)度沒有影響。

2.7 選擇性分析

圖3 選擇性實(shí)驗(yàn)Fig.3 Experiments for selection

實(shí)驗(yàn)分別向雜交Buffer中加入500 nmol/L的不同金屬離子，通過檢測體系的熒光強(qiáng)度，考察鉛離子的選擇性(圖3)。由圖3可知，只有當(dāng)鉛離子存在時，熒光強(qiáng)度才有非常明顯的降低，說明此實(shí)驗(yàn)只對鉛離子具有良好選擇性，對其他金屬離子影響不大，適合用于鉛離子檢測。

2.8 實(shí)際樣品檢測

為驗(yàn)證該傳感器在實(shí)際樣品檢測中的可靠性，選取本實(shí)驗(yàn)室的自來水進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。實(shí)際水樣用反應(yīng)的緩沖溶液進(jìn)行稀釋，然后加入不同濃度的鉛離子，采用本生物傳感器進(jìn)行檢測。如表1所示，加入10、100、200 nmol/L鉛離子時，實(shí)際樣品的回收率為92.5%～108%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.5%～8.6%，方法顯示了在實(shí)際樣品檢測中的良好性能。

表1 實(shí)際樣品檢測結(jié)果Table 1 The results of real sample

3 結(jié) 論

本文設(shè)計了一種基于DNA雙鏈取代的策略和SG作為熒光染料插入劑區(qū)別單雙鏈進(jìn)行鉛離子檢測的熒光傳感方法。研究發(fā)現(xiàn)體系的熒光強(qiáng)度變化由鉛離子加入引起。在最佳條件下，鉛離子濃度與熒光強(qiáng)度分段呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，最低檢測濃度為2 nmol/L，檢出限(S/N=3)為1.6 nmol/L。本方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡便快速等優(yōu)點(diǎn)，而且采用無標(biāo)記的方法，降低了檢測成本，適用于實(shí)際樣品的檢測。

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