★ 周昕 李蕓 楊俊 易鐵鋼 易無(wú)庸（深圳市中醫(yī)院/廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院腎病科廣東 深圳 518033）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）是一類(lèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病，蛋白尿是CKD進(jìn)展的重要危險(xiǎn)因素，蛋白尿引起的腎小管損傷在腎臟疾病進(jìn)展中扮演了重要角色［1］。蛋白尿?qū)е碌哪I小管上皮細(xì)胞（tubular epithelial cell，TEC）凋亡是腎小管萎縮進(jìn)而走向小管間質(zhì)纖維化的重要因素［2］。在各種凋亡通路中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān) PERK-CHOP（PKR-like endoplasmic reticulum kinase，C/EBP-homologous protein） 通 路 在 蛋 白尿腎小管損傷中起到了重要作用［3］。阿霉素腎病（adriamycin nephropathy，AN）動(dòng)物模型是一種慢性持續(xù)性蛋白尿模型，對(duì)研究持續(xù)性蛋白尿誘導(dǎo)的腎小管損傷具有很好的價(jià)值［4-6］。有研究顯示黃芩素對(duì)腎臟疾病有一定的保護(hù)作用［7-9］，但其是否通過(guò)調(diào)節(jié)PERK-CHOP凋亡通路起到腎小管保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究擬從PERK-CHOP凋亡通路探討黃芩素對(duì)蛋白尿腎小管損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18只雄性Wistar大鼠，體重170～220 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水、攝食。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用藥、試劑及主要儀器 阿霉素（Sigma Aldrich，St. Louis，MI，USA），黃芩素（南京崇原生物有限公司），p-PERK一抗（Cell signaling Tec，MA，USA），western blot濃度為1∶500，免疫組化濃度1∶100，CHOP一抗（Cell signaling Tec，MA，USA），western blot濃度為1∶1000，免疫組化濃度為 1∶100，二 抗（Cell signaling Tec，MA，USA），免疫組化試劑盒（Maixin-Bio，F(xiàn)uzhou，China），TUNEL 檢測(cè)試劑盒（Merck，Darmstadt，Germany），大鼠代謝籠（Tecniplast，Buguggiate，Italy），熒光顯微鏡（Nikon Corporation，Tokyo，Japan），垂直電泳儀（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），羅氏全自動(dòng)生化分析儀。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制作及干預(yù) 將18只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（正常組，n=6）、阿霉素腎病組（模型組，n=6）和阿霉素腎病+黃芩素觀察組（觀察組，n=6），模型組和觀察組一次性尾靜脈注射阿霉素2.0 mg/kg誘導(dǎo)阿霉素腎病動(dòng)物模型，正常組注射等量生理鹽水。造模后第1d開(kāi)始，觀察組予黃芩素300mg/（kg·d）灌胃，正常組和模型組予等量蒸餾水灌胃，共治療12周。

1.2.2 標(biāo)本采集與保存 黃芩素干預(yù)12周后，使用大鼠代謝籠收集各組大鼠24h尿液標(biāo)本。血液和腎臟組織樣本采集：10%水合氯醛按35mg/100g腹腔注射麻醉，沿腹正中線剖開(kāi)腹腔，從腹腔靜脈采集血液樣本，離心后留取血清，摘除腎臟，切取一半左腎用10%福爾馬林固定，經(jīng)脫水，透明，石蠟包埋，切片4μm，行腎組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)（TUNEL試劑盒測(cè)定）及免疫組織化學(xué)染色（p-PERK及CHOP）。剩余腎組織分離皮髓質(zhì)后凍存于-80℃冰箱，使用Western blot方法檢測(cè)腎皮質(zhì)中p-PERK和CHOP蛋白含量。

1.2.3 標(biāo)本測(cè)定 使用羅氏全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定24h尿蛋白定量、血清白蛋白、血清總蛋白、血肌酐、血尿素氮。使用TUNEL試劑盒檢測(cè)腎組織細(xì)胞凋亡情況，計(jì)數(shù)方法：每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡下視野（HPF，40×物鏡），每個(gè)視野計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性TEC個(gè)數(shù)，計(jì)算其平均值。免疫組化方法檢測(cè)腎組織中p-PERK和CHOP的表達(dá)分布，Western blot方法檢測(cè)腎皮質(zhì)組織中p-PERK及CHOP蛋白的含量，結(jié)果以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行比較，使用Bio-Rad全能成像儀（Bio-Rad Laboratories，California，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠24h尿總蛋白定量變化 第12周時(shí)，與正常組比較，模型組24h尿總蛋白定量明顯升高，黃芩素干預(yù)12周后，觀察組較模型組有明顯降低（圖1）。

圖1 各組大鼠24h尿總蛋白定量變化圖

2.2 各組大鼠血清白蛋白、總蛋白、血肌酐、血尿素氮變化 第12周時(shí)，與正常組比較，模型組血清白蛋白明顯下降（圖2a），血清總蛋白、血肌酐、血尿素氮變化無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2b，c，d）；觀察組血清白蛋白較模型組明顯升高（圖2a），血清總蛋白、血肌酐、血尿素氮變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2b，c，d）。

圖2 各組大鼠血清白蛋白、總蛋白、血肌酐、血尿素氮變化圖

2.3 各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況 第12周時(shí)，與正常組比較，模型組TUNEL陽(yáng)性TEC數(shù)量明顯增加，觀察組較模型組明顯減少（圖3）。

圖3 各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況圖

2.4 免疫組化染色顯示 p-PERK和CHOP主要表達(dá)于腎小管，腎小球可少量表達(dá)（圖4a）。Western blot結(jié)果顯示腎皮質(zhì)組織中，模型組p-PERK、CHOP較正常組明顯增多，黃芩素治療12周后p-PERK、CHOP明顯下降（圖4b，c，d）。

圖4 各組大鼠免疫組化染色比較圖

3 討論

腎小管損傷在CKD進(jìn)展中起到重要作用，持續(xù)大量蛋白尿可通過(guò)誘導(dǎo)TEC凋亡促進(jìn)小管萎縮、間質(zhì)纖維化的發(fā)展［10］。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定信號(hào)刺激下出現(xiàn)的自主性、程序性細(xì)胞死亡，PERK是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種跨膜蛋白，p-PERK為其活化狀態(tài)，很多因素可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，早期可促進(jìn)細(xì)胞存活，隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的延長(zhǎng)，PERK則通過(guò)誘導(dǎo)CHOP表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡［11］。

本研究結(jié)果顯示AN進(jìn)展至12周時(shí)，模型組24h尿蛋白定量明顯增加，血清白蛋白明顯降低，這表明動(dòng)物模型已進(jìn)入持續(xù)性大量蛋白尿期。該狀態(tài)下，TEC細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加，Western blot結(jié)果顯示PERK-CHOP通路顯著活化，而免疫組化染色結(jié)果顯示p-PERK、CHOP主要表達(dá)在TEC細(xì)胞中，腎小球中僅有少量表達(dá)，這表明PERK-CHOP凋亡通路可能參與了TEC細(xì)胞的凋亡進(jìn)展。黃芩素治療12周后，觀察組24h尿蛋白定量顯著降低，血清白蛋白明顯升高，TEC凋亡數(shù)量減少，腎皮質(zhì)組織中p-PERK和CHOP的蛋白含量也明顯下降，表明黃芩素可能通過(guò)調(diào)節(jié)PERKCHOP凋亡通路起到保護(hù)AN腎小管損傷的作用，但其制尚需進(jìn)一步研究。

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