★ 林文新 馬阮昕 馮真英（1.廣州市皮膚病防治所 廣州 510095；.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院藥學(xué)部 廣州 510655；.湛江市第二人民醫(yī)院 廣東 湛江 5400）

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細胞（中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院提供）；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（美國 Gibco公司）；川芎嗪（南京廣潤生物制品有限公司）；過氧化氫（重慶川東化工有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、一氧化氮（NO）試劑盒，均購買于南京建成生物工程公司。

1.2 細胞培養(yǎng) PC12細胞用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），置于細胞培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)，選取其對數(shù)生長期細胞進行下列實驗操作。

1.3 實驗分組及藥物劑量設(shè)計 實驗分組為：正常對照組、H2O2模型組（300μmol/L）、川芎嗪+H2O2（20nmol/L+300μmol/L）低劑量組、川芎嗪+ H2O2高劑量組（100nmol/L+300μmol/L）及陽性對照 Vit C + H2O2組（200mg/L+300 mol/L）。制備H2O2模型前，預(yù)先用不同濃度的川芎嗪處理川芎嗪+ H2O2低劑量組和高劑量組的PC12細胞，而陽性對照組加相應(yīng)濃度的Vit C處理PC12細胞，孵育24h后，洗滌除去培養(yǎng)基后，再加入300μmol/L的H2O2孵育24h制備氧化損傷模型。即除正常對照組外，其余各組均加入相應(yīng)濃度的H2O2和藥物培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24h后，檢測各項實驗指標。

1.4 MTT法檢測各組細胞的存活率 PC12細胞在含10%胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，先加入不同濃度川芎嗪（10～1000nmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)1h，然后加入300μmol/L的H2O2孵育24h后，接著每孔加入20μL噻唑藍（MTT，12mmol/L），37℃孵育4h，倒去上清液， 每孔加入二甲基亞砜（DMSO） 100μL，振蕩 3min，30min內(nèi)在960全自動酶標儀上測570nm處的吸光度值。另外，將1.3處理的PC12細胞孵育24h后，同樣按照上述MTT的操作步驟加入相對應(yīng)的干預(yù)藥物和H2O2， 測量570nm處的吸光度值，計算細胞增殖百分率。

1.5 LDH活性的測定 PC12細胞處理同1.3，PC12細胞在10%胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的川芎嗪（20nmol/L和100nmol/L）以及Vit C（200mg/L）繼續(xù)培養(yǎng)24h，再加入終濃度為300μmol/L H2O2刺激細胞4h，收集細胞外液。加入50μL的1% SDS，然后收集細胞層的細胞內(nèi)液，用日立7170生化自動分析儀測定細胞外液和細胞內(nèi)液中的LDH活性，以培養(yǎng)液中LDH活性單位占培養(yǎng)液加細胞層中LDH總活性單位的百分比作為LDH釋放的百分率。

1.6 MDA、SOD、NO的檢測 PC12細胞處理同1.3，各組細胞給藥時間結(jié)束后，收集各組培養(yǎng)基進行檢測。以TBA法測定MDA含量；以黃嘌呤氧化酶法測定SOD含量；以硝酸還原酶法測定NO含量。具體的檢測步驟按各試劑盒產(chǎn)品說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（）表示，采用ANVOA進行組間均數(shù)比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 川芎嗪對H2O2誘導(dǎo)PC12細胞的活力影響 從表1可知，與0nmol/L比較組比較，隨著川芎嗪劑量的升高，PC12細胞的存活率顯著增加（P＜0.01），但并不呈劑量依賴性，反而是逐漸降低；且1000nmol/L川芎嗪干預(yù)后，PC12細胞的存活率顯著降低（P＜0.05）。因此本實驗選擇20nmol/L和100nmol/L的川芎嗪分別作為低劑量和高劑量進行實驗。

從表2可知，與正常組比較，模型組的PC12細胞活力明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，川芎嗪+ H2O2低劑量、高劑量組，陽性對照Vit C + H2O2組中細胞活力皆顯著提高（P＜0.01）。

表1 川芎嗪對PC12細胞的活力影響（，n=6）

表1 川芎嗪對PC12細胞的活力影響（，n=6）

注：與0nmol/L比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

0 50.0±6.5 10 96.6±4.1**50 85.4±1.9**100 80.7±2.8**200 75.3±3.4**500 51.2±1.6**1000 39.8±0.5*

表2 各組藥物干預(yù)對PC12細胞的活力影響（，n=6）

表2 各組藥物干預(yù)對PC12細胞的活力影響（，n=6）

注：與H2O2模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

正常對照組 98.0±4.5##H2O2模型對照組 54.3±5.1川芎嗪+ H2O2低劑量組 98.3±5.7##川芎嗪+ H2O2高劑量組 81.0±4.1##陽性對照 Vit C + H2O2組 95.3±3.4##

2.2 川芎嗪對H2O2誘導(dǎo)PC12細胞的LDH釋放的百分率 從表3可知，與H2O2模型對照組比較，川芎嗪+ H2O2低、高劑量組和陽性對照 Vit C + H2O2組的LDH釋放率均顯著降低，提示這些組的PC12細胞的存活率顯著增加（P＜0.01）。

表3 川芎嗪對PC12細胞的LDH釋放的百分率（，n=6）

表3 川芎嗪對PC12細胞的LDH釋放的百分率（，n=6）

注：與H2O2模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

分組 百分率/%正常對照組 63.6±8.4**H2O2模型對照組 85.8±2.7川芎嗪+ H2O2低劑量組 58.8±3.0**川芎嗪+ H2O2高劑量組 60.1±2.1**陽性對照 Vit C + H2O2組 64.4±1.4**

2.3 川芎嗪對PC12細胞的MDA、SOD、NO的影響 從表4可知，與空白對照組比較，模型組細胞MDA水平顯著增加，SOD和NO含量顯著減少（P＜0.01）。與模型組比較，川芎嗪+ H2O2低、高劑量組和陽性對照 Vit C + H2O2組的細胞MDA水平顯著減少，SOD和NO含量顯著增加（P＜0.05）。

表4 川芎嗪對PC12細胞的MDA、SOD、NO的影響（，n=6）

注：與模型組比較，#P＜0.05,，##P＜0.01。

3 討論

川芎為傘形科植物川芎的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，本品辛溫行散，入血走氣，上行頭顛，下走血海。善活血行氣，祛風(fēng)止痛。治血瘀氣滯諸痛，兼寒者最宜，被前人譽為“血中之氣藥”。川芎嗪作為中藥川芎的有效成分，臨床上主要用于治療缺血性心腦血管疾病。另有研究表明，川芎嗪對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)均有不同程度的藥理作用。而研究川芎嗪對神經(jīng)方面的氧化應(yīng)激的研究較少。因此，本研究就著重探討川芎嗪對H2O2誘導(dǎo)PC12細胞的氧化應(yīng)激的作用。

SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，如動物、植物和微生物等。它是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，其在生物體內(nèi)的水平高低是衰老與死亡的直觀指標。本實驗中H2O2誘導(dǎo)PC12細胞的SOD比正常對照組顯著減少，說明模型細胞的自由基清除能力降低。而用川芎嗪干預(yù)后，SOD含量比模型細胞的顯著增加，這說明了給藥后可對抗因氧自由基對細胞造成的損害，減少氧化應(yīng)激引起的自由基造成的細胞傷害。

本實驗中H2O2誘導(dǎo)PC12細胞的MDA比正常對照組顯著減少，而NO比正常對照組顯著減少，說明模型細胞的氧化應(yīng)激程度增強和細胞損傷明顯。而用川芎嗪干預(yù)后，MDA含量比模型細胞的顯著減少，而NO含量比模型細胞的顯著增加，這說明了給藥后有緩解氧化應(yīng)激的作用，減少模型細胞的損傷。

綜上所述，川芎嗪通過減少H2O2誘導(dǎo)PC12細胞損傷模型的MDA和LDH水平，增加SOD和NO水平，進而緩解該細胞模型的氧化應(yīng)激，可見川芎嗪具有一定的抗氧化作用，這也為進一步考察它的作用機制和臨床使用提供指導(dǎo)作用。

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