李高榮，歐陽茜茜，楊 萍，陳法錦，黃 娜，李普旺，李思東，羅榮瓊

（1.廣東海洋大學(xué)海洋與氣象學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 湛江 524001；4.湛江健力源醫(yī)療用品有限公司，廣東 湛江 524022）

近年來，隨著人們生活方式的改變和生活節(jié)奏的加快，燒燙傷的發(fā)生率日益增高，給患者及家屬帶來無法彌補的傷害和巨大的經(jīng)濟損失［1］。目前治療燒燙傷的常用藥物有磺胺嘧啶銀和醋酸磺胺米隆，但是這些藥物具有生產(chǎn)成本高、副作用嚴(yán)重，對深部燒傷治療效果差、難以清除燒傷瘢痕等缺點［2-3］。因此，為滿足臨床應(yīng)用的迫切需求，開發(fā)一些治療燒燙傷的新型有效藥物十分必要。

海洋膠原蛋白是指從海洋動物中分離提取的膠原蛋白［4］，通過化學(xué)水解或酶水解可得到海洋膠原肽［5］。與海洋膠原蛋白相比，海洋膠原肽具有分子量較低、易于吸收、親水性強等特點［6］。由于海洋高壓、低溫和高鹽度的特殊環(huán)境，海洋膠原肽的物理化學(xué)性質(zhì)和氨基酸組成與陸源膠原肽的差別很大［7］，并具有獨特的生理功能，如抗菌、抗高血壓、抗氧化、抗皮膚老化和神經(jīng)保護等［8-12］。據(jù)報道，來自鮭魚皮膚的海洋膠原肽的口服給藥可增強大鼠的皮膚傷口愈合和血管生成［13］，羅非魚膠原蛋白靜電紡絲納米纖維可以促進(jìn)大鼠皮膚的傷口愈合［14］。

羅非魚是我國魚類養(yǎng)殖業(yè)的重要品種之一，據(jù)統(tǒng)計，我國每年羅非魚產(chǎn)量已超過140萬t，占世界產(chǎn)量的36.41%［15］。其中，10%以上的羅非魚經(jīng)過簡單加工，以凍魚片形式出口，在加工過程中產(chǎn)生了大量魚皮、魚鱗等下腳料。目前這些下腳料除了加工飼料外，沒有進(jìn)行高附加值的利用，造成極大的資源浪費［16］。有文獻(xiàn)報道，羅非魚皮含有豐富的膠原蛋白，可作為制備膠原蛋白肽的理想原料［17］。

鑒于此，本研究以海水養(yǎng)殖羅非魚皮為原料，通過酶的篩選和酶解正交試驗，分別獲得木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶酶解羅非魚皮的最優(yōu)酶解條件，在兩種酶的最優(yōu)酶解條件下進(jìn)行分步復(fù)合酶解制備羅非魚皮多肽，并探究羅非魚皮多肽對新西蘭兔皮膚燙傷創(chuàng)面的修復(fù)作用，以期為羅非魚皮多肽燙傷修復(fù)產(chǎn)品的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

羅非魚皮，由湛江國聯(lián)水產(chǎn)科技有限公司提供；菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶，南京龐博生物工程有限公司產(chǎn)品；鹽酸、氫氧化鈉、硫酸、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅、溴甲酚綠、無水乙醇，均為分析純，廣東光華科技股份有限公司產(chǎn)品；戊巴比妥鈉（AR），Sigma產(chǎn)品；濕潤燒傷膏（成分：黃連、黃柏、黃芩、地龍、罌粟殼），汕頭市美寶制藥有限公司產(chǎn)品。

實驗動物為新西蘭兔，60只，普通級，雌雄各半，體重為2 000（±200）g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物（三水基地）中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（粵）2014-0035，實驗動物質(zhì)量合格證明編號：44411600003615。

主要試驗儀器包括FA2004電子天平（上海閔勝科技有限公司）、PHS-3C型pH計（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、HH·S21-8-S電熱恒溫水浴鍋（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、Kjeltec?8400自動凱氏定氮儀〔福斯華（北京）科貿(mào)有限公司〕、噴霧干燥機（無錫市大峰噴霧干燥設(shè)備有限公司）、YSL-5Q臺式超級控溫燙傷儀（北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司）、IX73熒光顯微鏡（Olympus）。

1.2 試驗方法

1.2.1 羅非魚皮多肽的制備 羅非魚皮預(yù)處理及酶解工藝流程如下：羅非魚皮→除雜預(yù)處理→均質(zhì)打碎→恒溫酶解→高溫滅酶→離心分離→微孔膜抽濾→酶解液→噴霧干燥→多肽粉末。

將羅非魚皮剔除殘留的魚鱗和碎肉，加適量蒸餾水，經(jīng)100℃沸水浴加熱10 min，用均質(zhì)機均質(zhì)打碎（10 000 r/min），再加適量蒸餾水調(diào)節(jié)底物濃度，調(diào)節(jié)pH值，加酶恒溫酶解，控制反應(yīng)時間。100℃沸水浴滅酶后，10 000 r/min離心20 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜真空抽濾，得到酶解液，最后經(jīng)噴霧干燥得到多肽粉末。

（1）酶的篩選：選取實驗室常用的蛋白酶，在各酶最適pH值和溫度下進(jìn)行酶解，底物濃度、酶用量以及酶解時間一致，以酶解液的蛋白質(zhì)回收率為評價指標(biāo)，篩選出最合適的蛋白酶種類。各酶的酶解條件如表1所示。

表1 常用酶類酶解條件

（2）酶解正交試驗：選取酶解效果最好的兩種蛋白酶，以酶解pH值、酶解溫度、底物濃度以及酶用量為考察因素，以酶解液的蛋白質(zhì)回收率為評價指標(biāo)，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗。兩種酶正交試驗的因素和水平設(shè)計如表2所示。

表2 酶解正交試驗因素和水平

（3）復(fù)合酶解制備羅非魚皮多肽：根據(jù)酶解正交試驗的結(jié)果，在兩種酶的最適酶解條件下進(jìn)行分步復(fù)合酶解，制備羅非魚皮多肽。

（4）蛋白質(zhì)回收率測定：用凱氏定氮法分別測定酶解液和原料中的氮含量，計算蛋白質(zhì)回收率：

1.2.2 羅非魚皮多肽對新西蘭兔Ⅱ度燙傷的修復(fù)作用 （1）新西蘭兔燙傷模型的制備：試驗前24 h在新西蘭兔背部剃毛，用10%硫化鈉涂抹剃毛區(qū)進(jìn)行脫毛，待毛脫干凈時用生理鹽水清洗干凈，單籠飼養(yǎng)。新西蘭兔靜脈注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進(jìn)行麻醉，背部脫毛區(qū)皮膚以75%乙醇消毒后，使用YLS-5Q臺式超級控溫燙傷儀在兔背部中線外側(cè)2 cm各制備1個燙傷創(chuàng)面，創(chuàng)面面積為3 cm2，燙傷條件為：燙頭溫度100℃、作用壓力1 000 g、燙頭與皮膚接觸時間為6 s。

（2）試驗分組和給藥：模型兔隨機分為3組，分別是模型對照組、陽性對照組、實驗組，20只/組（雌雄各半）。模型對照組造模后不進(jìn)行給藥；陽性對照組造模后1 d開始，燙傷創(chuàng)面以潤濕燙傷膏進(jìn)行涂抹治療，每天涂抹1次（約1 mL），連續(xù)涂抹28 d；實驗組造模后1 d開始，燙傷創(chuàng)面以羅非魚皮多肽糊劑進(jìn)行涂抹治療，每天涂抹1次（約含羅非魚皮多肽100 mg），連續(xù)涂抹28 d。在造模當(dāng)天以及每次換藥時觀察創(chuàng)面的大小、顏色、炎癥、滲出液、感染、結(jié)痂以及脫痂等情況，并拍照記錄。

（3）燙傷創(chuàng)面愈合率測定：分別于造模后 1、3、7、10、14、17、21、24、28 d使用標(biāo)準(zhǔn)半透明稱量紙覆蓋在兔背部的燙傷創(chuàng)面，使用標(biāo)準(zhǔn)半透明稱量紙覆蓋在兔背部的燙傷創(chuàng)面，將創(chuàng)面邊緣描繪在半透明的稱量紙上，剪出創(chuàng)面形狀，計算紙片的面積，按照公式：創(chuàng)面愈合率（%）=（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100，計算創(chuàng)面愈合率。

（4）創(chuàng)面病理組織學(xué)觀察：分別于造模后1、7、14、21、28 d，各組隨機選取新西蘭兔4只，雌雄各半，切取背部各皮膚傷口中心及周圍區(qū)域的皮膚組織。所有皮膚樣品制成病理切片，經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色，于放大倍數(shù)為200×的光學(xué)顯微鏡下觀察各組創(chuàng)面愈合情況。

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。通過單因素方差分析比較各組間差異，P＜0.05則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類選擇

采用常用蛋白酶對羅非魚皮進(jìn)行酶解，結(jié)果各酶酶解所得的蛋白質(zhì)回收率分別為：菠蘿蛋白酶61.28（±2.65）%、木瓜蛋白酶89.62（±1.45）%、胰蛋白酶71.95（±3.27）%、胃蛋白酶67.71（±2.21）%、堿性蛋白酶88.43（±1.84）%、中性蛋白酶86.52（±1.62）%?？梢?，木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶酶解所得的蛋白質(zhì)回收率最高，水解效果最好，因此選擇木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶作為水解酶。

2.2 解正交試驗及優(yōu)化驗證

2.2.1 堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的正交試驗 堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的正交試驗結(jié)果和方差分析結(jié)果見表3～表6。由表3、表5可知，影響羅非魚皮酶解所得蛋白質(zhì)回收率的主次因素順序：堿性蛋白酶為A＞B＞D＞C，即pH＞溫度＞酶用量＞底物濃度；木瓜蛋白酶為A＞B＞C＞D，即pH＞溫度＞底物濃度＞酶用量；酶解羅非魚皮最優(yōu)因素組合：木瓜蛋白酶為A2B2C2D3，即pH6.5、溫度55℃、底物濃度30%、酶用量0.5%；堿性蛋白酶為A2B2C3D2，即pH9.5、溫度45℃、底物濃度35%、酶用量0.4%。

由表4、表6可知，通過蛋白質(zhì)回收率的顯著性方差分析可知，pH值對木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶酶解所得蛋白質(zhì)回收率的影響均顯著，其他3個因素的影響則都不顯著。

表3 木瓜蛋白酶酶解羅非魚皮L9 （34）正交實驗結(jié)果

表4 木瓜蛋白酶酶解所得蛋白質(zhì)回收率的方差分析

2.2.2 正交優(yōu)化條件的驗證 經(jīng)正交試驗優(yōu)化得到兩種酶的最優(yōu)因素組合：木瓜蛋白酶為pH6.5、溫度55℃、底物濃度30%、酶用量0.5%；堿性蛋白酶為pH9.5、溫度45℃、底物濃度35%、酶用量0.4%。以蛋白質(zhì)回收率為指標(biāo)，驗證正交優(yōu)化條件，結(jié)果蛋白質(zhì)回收率分別為：木瓜蛋白酶90.54（±1.72）%、堿性蛋白酶89.22（±2.14）%。

表6 堿性蛋白酶酶解所得蛋白質(zhì)回收率的方差分析

2.3 堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶的復(fù)合酶解

在正交試驗基礎(chǔ)上，設(shè)定木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶兩種酶的最優(yōu)酶解條件，通過改變酶添加順序進(jìn)行復(fù)合酶解，先加木瓜蛋白酶酶解2 h后加堿性蛋白酶酶解2 h的蛋白質(zhì)回收率為95.13（±1.42）%；先加堿性蛋白酶酶解2 h后加木瓜蛋白酶酶解2 h的蛋白質(zhì)回收率為95.05（±1.12）%，均值為95.09（±1.27）%?？梢姡砑用傅南群箜樞驇缀醪挥绊憦?fù)合酶解的結(jié)果，這可能是因為兩種酶對底物的作用位點不同，且一種酶的酶解作用不影響另一種酶的作用。復(fù)合酶解所得的蛋白質(zhì)回收率比單一酶的更高，較最優(yōu)酶解條件下的木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶分別提高5.03%和6.58%，說明由于不同蛋白酶具有不同作用位點，采用復(fù)合水解可產(chǎn)生互補效應(yīng)，能進(jìn)一步提高酶解度。綜上，選擇在兩種酶的最優(yōu)酶解條件下，分步復(fù)合酶解制備羅非魚皮多肽。

2.4 燙傷創(chuàng)面的宏觀評價

各組燙傷創(chuàng)面不同時間的愈合情況如圖1（彩插三）所示：造模后1 d，各組燙傷創(chuàng)面呈近圓形，與周圍組織界限分明，部分表皮剝脫，真皮層軟化發(fā)白；造模后4 d，各組燙傷創(chuàng)面均出現(xiàn)壞死癥狀，有組織液滲出和膿性物分泌，創(chuàng)周炎癥反應(yīng)明顯，創(chuàng)緣紅腫、擴張；造模后7 d，實驗組與陽性對照組燙傷創(chuàng)面水腫開始消退，部分痂皮覆蓋，創(chuàng)面干燥、無組織液滲出，模型對照組燙傷水腫未見明顯消退，少量痂皮覆蓋，創(chuàng)面較為濕潤，創(chuàng)周有少量膿性分泌物；造模后14 d，各組燙傷創(chuàng)面外周痂皮大部分脫落，創(chuàng)面干燥，無組織液滲出和膿性物分泌，創(chuàng)面縮小，創(chuàng)周與周圍正常組織界限不明顯，實驗組和陽性對照組的創(chuàng)面縮小情況均優(yōu)于模型對照組；造模后21 d，實驗組燙傷創(chuàng)面痂皮基本脫落，而模型對照組和陽性對照組中間部分仍有少量痂皮附著，呈淡紅色；造模后28 d，各組燙傷創(chuàng)面痂皮均已基本脫落，創(chuàng)面已全愈合，創(chuàng)面區(qū)域無毛發(fā)生長。

2.5 燙傷創(chuàng)面愈合率的變化

各組燙傷創(chuàng)面不同時間的創(chuàng)面愈合率變化如表7所示。由于燙傷創(chuàng)面的壞死和炎癥反應(yīng)，組織液滲出和膿性物分泌引起創(chuàng)周紅腫及邊緣擴大，因此藥后3 d的愈合率出現(xiàn)負(fù)值，也導(dǎo)致給藥后的前7 d，3組的創(chuàng)面愈合率無明顯差異。與模型對照組相比，實驗組的創(chuàng)面愈合率在造模后10 d開始出現(xiàn)顯著性差異，而陽性對照組在造模后14 d才開始有顯著性差異，尤其是造模后17、21、24 d，實驗組和陽性對照組的創(chuàng)面愈合率極顯著高于模型對照組。實驗組與陽性對照組的創(chuàng)面愈合率未見明顯差異，愈合效果相近。

表7 各組燙傷創(chuàng)面不同時間的創(chuàng)面愈合率（%）比較

2.6 燙傷創(chuàng)面的病理組織學(xué)評價

創(chuàng)面組織切片的HE染色觀察如圖2（彩插三）所示：造模后1 d，創(chuàng)面表皮層和部分真皮層凝固性壞死，可見皮下水腫，炎性細(xì)胞浸潤，真皮間質(zhì)擴張疏松，皮膚附件被嚴(yán)重破壞，符合Ⅱ度燙傷病理特征；造模后7 d，各組均觀察到炎性細(xì)胞浸潤，并有明顯的痂皮出現(xiàn)，但未觀察到再上皮化；造模后14 d，模型對照組炎性細(xì)胞較多，表皮恢復(fù)不明顯，陽性對照組和實驗組創(chuàng)面再上皮化明顯，表皮恢復(fù)較好，角質(zhì)層重建表皮恢復(fù)較好，角質(zhì)層重建，真皮層間質(zhì)緊密；造模后21 d，模型對照組傷口僅部分再上皮化，陽性對照組大部分完成傷口的再上皮化，實驗組已完成傷口的再上皮化；造模后28 d，模型對照組、陽性對照組和實驗組均已完成傷口再上皮化，實驗組表皮增厚最大，真皮層間質(zhì)緊密，成纖維細(xì)胞成梭型有序排列，恢復(fù)情況最好。

3 結(jié)論與討論

本研究以羅非魚皮為原料，通過酶的篩選，選取酶解效果最好的木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶，進(jìn)行酶解正交試驗，得到兩種酶的最優(yōu)酶解條件，并在最優(yōu)酶解條件下，進(jìn)行雙酶分步復(fù)合酶解制備羅非魚皮多肽，所得的蛋白質(zhì)回收率均比最優(yōu)酶解條件下單酶的更高。對復(fù)合酶解所得的羅非魚皮多肽進(jìn)行新西蘭兔燙傷試驗，結(jié)果表明，羅非魚皮多肽對皮膚燙傷創(chuàng)面有很好的修復(fù)作用。

由于蛋白酶對底物作用具有一定的專一性，不同的蛋白酶具有不同的作用位點，采用單酶水解時，只能從特定的水解位點，即從幾個固定的氨基酸殘基進(jìn)行水解，故水解程度受到限制。采用多酶復(fù)合酶解可以通過不同水解位點的互補作用彌補單酶水解的不足，進(jìn)而提高底物的水解程度［18］。

燒燙傷在臨床上比較常見，是一種由熱力、化學(xué)物質(zhì)、電流及放射線所引起的外傷性疾病，其中以熱燒傷最為常見［19］。傷口愈合是最復(fù)雜的生物過程之一，通過細(xì)胞增殖、遷移、胞外基質(zhì)合成、血管形成、上皮化以及組織重建等一系列修復(fù)作用而實現(xiàn)［20］。角質(zhì)形成細(xì)胞再上皮化是傷口愈合的細(xì)胞機制之一，其主要依賴角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和遷移［21］。角質(zhì)形成細(xì)胞增殖可確保更多的細(xì)胞遷移，加速再上皮化過程，促進(jìn)傷口愈合［22］。轉(zhuǎn)化生長因子 -β1（TGF-β1）是傷口愈合過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的重要因素，在傷口愈合的每個階段，TGF-β1可抑制炎癥反應(yīng)并促進(jìn)肉芽組織的形成［23］。本研究認(rèn)為，羅非魚皮多肽可通過減少炎癥反應(yīng)，促進(jìn)上皮再生，從而加速燙傷創(chuàng)面的愈合過程、提高愈合效果。推測羅非魚皮多肽可促進(jìn)TGF-β1的釋放，從而抑制炎癥反應(yīng)并促進(jìn)肉芽組織的形成［24］，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖并刺激表皮分化，加速再上皮化［14］。

［1］ Edelman L. Social and economic factors associated with the risk of burn injury［J］. Burns，2007，33（8）：958-965.

［2］ Shanmugasundaram N，Uma T S，Ramyaa Lakshmi T S，et al. Efficiency of controlled topical delivery of silver sulfadiazine in infected burn wounds［J］. Journal of Biomedical Materials Research（Part A），2009，89（2）：472-482.

［3］ Johnson R M，Richard R. Partial-thickness burns：identification and management［J］.Advances in Skin & Wound Care，2003，16（4）：178-187.

［4］ 蔣升，蔚一博，徐曉剛. 海洋膠原蛋白的提取及在組織工程學(xué)中的研究進(jìn)展［J］. 藥物生物技術(shù)，2017（2）：180-184.

［5］ Vijaykrishnaraj M，Prabhasankar P. Marine protein hydrolysates：Their present and future perspectives in food chemistry—A review［J］.RSC Adv，2015，5：34864-34877.

［6］ Fan L，Cao M，Gao S，et al. Preparation and characterization of sodium alginate modified with collagen peptides［J］. Carbohydr Polym，2013，93：380-385.

［7］ Lin Y K，Deng C L. Comparison of physical–chemical properties of type I collagen from different species［J］. Food Chemistry，2006，99（2）：244-251.

［8］ Ennaas N，Hammami R，Gomaa A，et al.Collagencin，an antibacterial peptide from fish collagen：Activity，structure and interaction dynamics with membrane［J］. Biochem Biophys Res Commun，2016，473：642-647.

［9］ Kim S K，Ngo D H，Vo T S. Marine fish-derived bioactive peptides as potential antihypertensive agents［J］. Adv Food Nutr Res，2012，65：249-260.

［10］ 劉文穎，徐姍姍，谷瑞增，等. 海洋膠原低聚肽中抗氧化肽的分離及鑒定［J］. 食品工業(yè)科技，2017（6）：101-105，109.

［11］ Tanaka M，Koyama Y，Nomura Y. Effects of collagen peptide ingestion on UV-B-induced skin damage［J］. Biosci Biotechnol Biochem，2009，73：930-932.

［12］ Xu L，Dong W，Zhao J，et al. Effect of marine collagen peptides on physiological and neurobehavioral development of male rats with perinatal asphyxia［J］. Mar Drugs，2015，13：3653-3671.

［13］ Zhang Z，Wang J，Ding Y，et al. Oral administration of marine collagen peptides from Chum Salmon skin enhances cutaneous wound healing and angiogenesis in rats［J］. J Sci Food Agric，2011，91：173-179.

［14］ Zhou T，Wang N，Xue Y，et al. Electrospun tilapia collagen nanofibers accelerating wound healing via inducing keratinocytes proliferation and differentiation［J］. Colloids Surf B Biointerfaces，2016，143：415-422.

［15］ 張紅燕，袁永明，賀艷輝，等. 中國羅非魚生產(chǎn)與貿(mào)易現(xiàn)狀分析及建議［J］. 中國漁業(yè)經(jīng)濟，2015（3）：95-100.

［16］ 趙志霞，吳燕燕，李來好，等. 我國羅非魚加工研究現(xiàn)狀［J］. 食品工業(yè)科技，2017（9）：363-367，373.

［17］ 葉小燕，曾少葵，余文國，等. 羅非魚皮營養(yǎng)成分分析及魚皮明膠提取工藝的探討［J］. 南方水產(chǎn)，2008（5）：55-60.

［18］ 王運改，林琳，李明輝，等. 鮰魚皮明膠抗氧化肽的制備工藝研究［J］. 食品科學(xué)，2010，31（19）：254-258.

［19］ 黃夢玲，王雄，吳金虎. 中藥治療燒燙傷的作用機制研究進(jìn)展［J］. 醫(yī)學(xué)綜述，2017，23（11）：2240-2244.

［20］ Pazyar N，Yaghoobi R，Rafiee E，et al. Skin wound healing and phytomedicine：a review［J］.Skin Pharmacology and Physiology，2014，27（6）：303-310.

［21］ Gurtner G C，Werner S，Barrandon Y，et al.Wound repair and regeneration［J］. Nature，2008，453（7193）：314-321.

［22］ Chen X，Shi Y，Shu B，et al. The effect of porcine ADM to improve the burn wound healing［J］.International Journal of Clinical & Experimental Pathology，2013，6（11）：2280-2291.

［23］ Werner S，Grose R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines［J］. Physiological Reviews，2003，83（3）：835-870.

［24］ Liu H，Mu L，Tang J，et al. A potential wound healing-promoting peptide from frog skin［J］.The International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2014，49：32-41.