龍 陽(yáng)，馬新華，袁俊杰，盧乃會(huì)，楊卓瑜，魏 霜，王衛(wèi)芳

（1.湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 湛江 524042；2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 廣州 510623）

油菜莖基潰瘍病菌是油菜上最嚴(yán)重的真菌病害之一，是我國(guó)重要的檢疫性有害生物［1］。近年來(lái)，湛江口岸多次從進(jìn)境油菜籽樣品中截獲該病菌。油菜莖基潰瘍病菌正嚴(yán)重威脅著我國(guó)油菜產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)安全，高效快速檢測(cè)技術(shù)成為預(yù)防油菜莖基潰瘍病傳入我國(guó)的關(guān)鍵措施之一。目前油菜莖基潰瘍病菌常用檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)法以及發(fā)病癥狀觀察法［2-4］。其中，分離培養(yǎng)法培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，工作量大，如果完全通過(guò)分離培養(yǎng)來(lái)完成對(duì)病害的檢疫鑒定，針對(duì)性差，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，與快速通關(guān)的需求不符；PCR檢測(cè)法具有快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，但是其對(duì)檢測(cè)設(shè)備和檢測(cè)人員要求較高，難以適用于多種檢測(cè)環(huán)境；發(fā)病癥狀觀察法由于某些病原引起的癥狀相似，較難準(zhǔn)確判定。本研究采用的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)區(qū)別于傳統(tǒng)的PCR法［5］，其不需要昂貴的PCR儀器，且特異性強(qiáng)、靈敏高、操作簡(jiǎn)單、擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間較短，比較容易在基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于各類植物病原菌的檢測(cè)工作中。張?jiān)＞龋?］應(yīng)用該技術(shù)成功檢測(cè)了苜蓿疫霉根腐病菌，Tomlinson等［7］等建立了灰霉病菌的LAMP檢測(cè)方法，Niessen等［8］運(yùn)用LAMP技術(shù)檢測(cè)出了禾谷鐮刀菌，田擎等［9］檢測(cè)了黑白輪枝菌，戎振洋等［10］以TAT基因?yàn)榘袠?biāo)設(shè)計(jì)了一套用于檢測(cè)水稻中Fusarium andiyazi的LAMP檢測(cè)方法。雖然LAMP技術(shù)存在諸多優(yōu)點(diǎn)，但也存在易污染、假陽(yáng)性等缺陷［11］。

本研究通過(guò)在建立的油菜莖基潰瘍病菌LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系中添加羥基萘酚藍(lán)（hydroxy naphthol blue，HNB）反應(yīng)指示劑［12］，反應(yīng)完成后可以以通過(guò)肉眼直接對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，無(wú)需再開蓋檢測(cè)，可以有效避免氣溶膠污染，預(yù)防LAMP檢測(cè)過(guò)程中常見(jiàn)的假陽(yáng)性問(wèn)題，一定程度上克服了LAMP技術(shù)易污染的缺點(diǎn)，對(duì)預(yù)防油菜莖基潰瘍病傳入我國(guó)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

油菜莖基潰瘍病菌L. maculans陽(yáng)性DNA來(lái)源于《CNCA-15-A03油菜莖基潰瘍病菌檢測(cè)》能力驗(yàn)證陽(yáng)性樣品。 燕麥細(xì)鐮刀菌Fusarium avenaceum、鏈格孢屬Alternariasp.、莖點(diǎn)霉屬Phomasp.、核盤菌Sclerotinia sclerotiorum；油菜黑脛病菌L.biglobosa分離于進(jìn)口加拿大油菜籽。取10批油菜籽樣品，按照《GB/T31793-2015油菜莖基潰瘍病菌檢疫鑒定方法》中4.1的要求對(duì)其進(jìn)行前處理。

植物基因組DNA提取試劑盒DP305-03，購(gòu)自TIANGEN公司； DL2000 Premix DNA Marker購(gòu)自Takara公司；Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶購(gòu)自New England Biolabs公司;羥基萘酚藍(lán)（HNB）購(gòu)自Sigma公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 按照植物基因組DNA提取試劑盒DP305-03的要求對(duì)1.1中樣品進(jìn)行基因組DNA提取。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 參考LAMP引物設(shè)計(jì)方法和要求［1］，根據(jù)油菜莖基潰瘍病菌ITS保守序列設(shè)計(jì)LAMP引物1套（表1）。常規(guī)PCR引物參照《GB/T 31793-2015油菜莖基潰瘍病菌檢疫鑒定方法》4.5.2常規(guī)PCR方法一中的引物，產(chǎn)物大小為 279 bp［13］。

表1 油菜莖基潰瘍病菌LAMP檢測(cè)引物序列

1.2.3 LAMP-HNB反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 對(duì)LAMP反應(yīng)體系中的Mg2+濃度（1～6 mmol/L）、dNTPs濃度（0.2～2 mmol/L）、F3/B3引物濃度（0.1～0.5 μmol/L）、FIP/BIP引物濃度（0.4～2.0 μmol/L）、HNB 濃度（50～250 μmol/L）、Bst DNA聚合酶濃度（0.08～0.64 U/μL），反應(yīng)溫度（60～70℃）及反應(yīng)時(shí)間（30～90 min）進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 LAMP-HNB特異性評(píng)價(jià) 按照1.2.3中LAMP反應(yīng)體系，以1.2.1中提取的5個(gè)樣品基因組DNA為模板，以油菜莖基潰瘍病菌基因組DNA為模板做陽(yáng)性對(duì)照，以水為模板做陰性對(duì)照，對(duì)所建立的LAMP-HNB反應(yīng)體系的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.5 LAMP-HNB靈敏度評(píng)價(jià) 以1.2.1的方法提取油菜莖基潰瘍病菌基因組DNA，用核酸蛋白分析儀標(biāo)定濃度為100 ng/μL，再按10倍梯度稀釋為 10 、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL的模板濃度，共6個(gè)模板濃度，分別取2 μL作為模板按照1.2.3的方法進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 LAMP-HNB體系對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè) 利用LAMP-HNB體系對(duì)10批油菜籽樣品進(jìn)行檢測(cè)，將得到的結(jié)果與常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP-HNB檢測(cè)方法建立

通過(guò)調(diào)整優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系，確定最終反應(yīng)體系為10×等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)緩沖液2.5 μL，Mg2+4.0 mmol/L，dNTP Mix 1.0 mmol/L，F(xiàn)3、B3引物終濃度0.2 μmol/L，F(xiàn)IB、BIP引物終濃度1.6 μmol/L， HNB150 μmol/L，Bst2.0 WarmStart DNA聚合酶0.16 U/μL，DNA模板2.0μL，ddH2O調(diào)節(jié)最終體積至25μL。反應(yīng)條件為62℃ 80 min。結(jié)果見(jiàn)圖1（彩插二），陽(yáng)性樣品顯示為天藍(lán)色，陰性對(duì)照未反應(yīng)為淺藍(lán)色；LAMP反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，陽(yáng)性樣品有典型的LAMP反應(yīng)條帶，陰性對(duì)照無(wú)反應(yīng)條帶，與顯色反應(yīng)一致。

2.2 LAMP-HNB特異性評(píng)價(jià)

如圖2（彩插二）所示，僅油菜莖基潰瘍病菌陽(yáng)性DNA發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)變?yōu)樘焖{(lán)色，其他5種油菜籽中常見(jiàn)的菌株均未發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，呈淺藍(lán)色。表明所建立的LAMP-HNB檢測(cè)方法特異性強(qiáng)。

2.3 LAMP-HNB靈敏度評(píng)價(jià)

如圖3（彩插二）所示，當(dāng)DNA模板量在0.01 ng/μL以上時(shí)，LAMP-HNB均能發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)而顯色，而常規(guī)PCR檢測(cè)在0.1 ng/μL時(shí)結(jié)果已經(jīng)較為微弱，低于0.1 ng/μL時(shí)已經(jīng)無(wú)法獲得陽(yáng)性結(jié)果，LAMP-HNB方法的靈敏度是常規(guī)PCR的10倍。

2.4 LAMP-HNB對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

如圖4（彩插二）所示，利用LAMP-HNB及常規(guī)PCR對(duì)10批油菜籽樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出5批陽(yáng)性樣品，兩者檢測(cè)結(jié)果一致。

3 討論

LAMP方法是一種靈敏度極高的檢測(cè)方法，其靈敏度一般可達(dá)到普通PCR的10倍以上，因此如果采用常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行判定，極易產(chǎn)生氣溶膠污染，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性。為避免污染的產(chǎn)生，閉管檢測(cè)并直接進(jìn)行結(jié)果判定的方法被廣泛研究，目前閉管判定常用的方法有目視濁度法、濁度儀檢測(cè)法、染料顯色法等三大類，由于LAMP反應(yīng)中會(huì)產(chǎn)生大量的焦磷酸根離子，其能與反應(yīng)體系中的鎂離子結(jié)合生成焦磷酸鎂白色沉淀，這為肉眼判定結(jié)果提供可能，但是當(dāng)濁度較低時(shí)，肉眼難以準(zhǔn)確判定；濁度儀檢測(cè)法主要依靠專用設(shè)備實(shí)時(shí)對(duì)反應(yīng)體系中的渾濁度進(jìn)行檢測(cè)，但是其需要專用設(shè)備，不利于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；染料顯色法是目前LAMP閉管檢測(cè)研究應(yīng)用的重點(diǎn)方向，其中鈣黃綠素顯色法會(huì)降低反應(yīng)靈敏度，SYBR Green染料顯色需經(jīng)特殊處理或反應(yīng)后開蓋加入，各有弊端［11，13-14］。本研究采用的羥基萘酚藍(lán)顯色法不需額外添加任何成分，對(duì)反應(yīng)體系影響較小，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用，但需注意的是，陰性反應(yīng)顯色結(jié)果與反應(yīng)體系中是否存在甜菜堿相關(guān)，當(dāng)存在時(shí)，呈紫羅蘭色，當(dāng)不存在時(shí)，則呈淺藍(lán)色［6，10，12］。

油菜莖基潰瘍病是油菜上最嚴(yán)重的真菌病害之一，其致病力強(qiáng)，造成損失大，據(jù)估計(jì)，全世界因此病而造成油菜經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)3億歐元［15］。該病原菌廣泛分布于亞洲、非洲、美洲、歐洲及大洋洲等地，但在我國(guó)還未見(jiàn)報(bào)道。該病菌能通過(guò)植株、種子等進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，我國(guó)是油菜種植大國(guó)，且各方面條件都適宜該病菌繁衍，因此一旦該病菌傳入我國(guó)并定殖，可能會(huì)對(duì)我國(guó)相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成毀滅性破壞。本研究建立的油菜莖基潰瘍病菌LAMP-HNB檢測(cè)方法，具有特異性強(qiáng)、適用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，適用該病菌的快速篩檢，運(yùn)用該方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與GB/T 31793-2015中PCR方法檢測(cè)結(jié)果一致，且耗時(shí)更短，對(duì)油菜莖基潰瘍病菌的快速篩查具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

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