霍彩云，邢海云，唐玉玲，郭曉桐，楊光輝，李穎鑫，王書揚(yáng)，胡艷欣

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193； 2.中國(guó)奶業(yè)協(xié)會(huì)，北京 海淀 100193)

缺陷型基因組(DefectiveInterferingviruses，DI)病毒是指含有不完整的基因組片段的病毒粒子，這些病毒粒子可以有效地干擾完整具有感染性的子代病毒粒子的產(chǎn)生。DI病毒最早發(fā)現(xiàn)于流感病毒中，Von Magnus 在雞胚中增殖流感病毒時(shí)觀察到使用過(guò)高M(jìn)OI的病毒接種，得到的新一代病毒的滴度反而下降[1]。近年來(lái)，由于其獨(dú)特的抗病毒功能，使缺陷病毒被越來(lái)越多的科學(xué)家關(guān)注，并且被作為疫苗佐劑廣泛的應(yīng)用于臨床中。本文從缺陷病毒的結(jié)構(gòu)、功能、檢測(cè)方法以及臨床應(yīng)用等方面加以綜述，以期為缺陷病毒在臨床中的應(yīng)用提供借鑒。

1 結(jié)構(gòu)

根據(jù)結(jié)構(gòu)特征，可將DI病毒分為缺失型和回折型這兩種類型：在單股負(fù)鏈RNA病毒中，缺失型DI病毒的產(chǎn)生是由于病毒聚合酶只在基因片段的前端發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用，或者聚合酶跳過(guò)了中間的部分直接到末端開(kāi)始轉(zhuǎn)錄而缺失了基因片段的中間部分，因此親代基因3端和5端的含有啟動(dòng)子的遺傳信息被保留，而含有關(guān)鍵基因的中間部分被刪除[2]?；卣坌虳I病毒具有1個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，包含標(biāo)準(zhǔn)基因片段的10%～60%，并且含有標(biāo)準(zhǔn)基因片段不存在的互補(bǔ)末端序列。是其聚合酶在工作過(guò)程中脫離了模板，并利用已經(jīng)轉(zhuǎn)錄的片段作為模板繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，這一過(guò)程就形成了互補(bǔ)的3端到5端片段。回折型又分為Copy back 和Snap-back。Copy back 具有一個(gè)環(huán)狀的結(jié)構(gòu)而Snap-back 中互補(bǔ)的片段占據(jù)了差不多整個(gè)缺陷病毒的結(jié)構(gòu)[3-4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在PR8-H1N1感染的小鼠體內(nèi)和病人的上呼吸道組織中均發(fā)現(xiàn)了DI病毒的存在[5-6]。流感病毒屬于正黏病毒科，結(jié)構(gòu)中包含8個(gè)不同的單股負(fù)鏈基因組片段(PB1/PB2/HA/PA/NA/NP /NS/M)，基因組大小約為1 000～2 000個(gè)堿基對(duì)，共同編譯12～14種病毒蛋白，具有感染性的病毒粒子需要包含所有的基因片段，DI病毒含有至少一個(gè)缺失的基因片段，因此不具有感染性[7]。到目前為止，DI病毒產(chǎn)生的缺失多發(fā)生在PB2、PB1、PA這些編碼聚合酶的基因片段和M基因片段。Xue J. 等研究者在最新研究結(jié)果中表明H1N1流感毒株中存在HA缺失DI病毒，同時(shí)他們還證實(shí)了當(dāng)流感病毒感染細(xì)胞時(shí)使用較高的感染復(fù)數(shù)或當(dāng)感染時(shí)間增長(zhǎng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生缺陷型病毒粒子，由于缺陷型流感病毒的結(jié)構(gòu)屬于中間部分缺失型，相對(duì)于完整的基因片段堿基對(duì)要少。因此當(dāng)使用通用型引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增病毒基因片段時(shí)會(huì)產(chǎn)生較小的產(chǎn)物，一般在300～600個(gè)堿基對(duì)間[8]。在H3N2亞型流感病毒感染小鼠肺組織中也可檢測(cè)到PB1、PB2、PA基因缺失的DI病毒[9]?？傊煌牧鞲胁《?，產(chǎn)生缺陷型基因組的能力及其來(lái)源不盡相同，即使來(lái)自同一基因組片段，其基因序列也有可能不同。除流感病毒外，人們?cè)趶棤畈《救缢捫钥谘撞《?VSV)和狂犬病病毒(RV)、副黏病毒科中的仙臺(tái)病毒(SeV)、呼吸道合胞體病毒(RSV)和麻疹病毒(MV)，以及沙狀病毒科腦膜炎病毒(LCMV)中也發(fā)現(xiàn)了缺陷型病毒粒子的存在[10-17]。同時(shí)，在正鏈單股RNA病毒中，如脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)、甲肝病毒(HAV)、登革熱病毒(DENV)、西尼羅河病病毒(WNV)、艾滋病病毒HIV和丙肝病毒(HCV)中都會(huì)產(chǎn)生缺陷型病毒粒子[18-21]。

2 功能

DI病毒有兩大主要功能，包括干擾正常的完整的病毒的復(fù)制和刺激宿主的抗病毒免疫反應(yīng)。

2.1 干擾正常的完整的病毒的復(fù)制 當(dāng)DI病毒與具有完整感染性的病毒共同培養(yǎng)時(shí)，DI病毒需要后者的輔助才能復(fù)制，但是由于結(jié)構(gòu)的縮短和其具有的高效的啟動(dòng)子區(qū)域使得DI病毒更易于復(fù)制，當(dāng)復(fù)制積累到一定程度以后，這些DI病毒能占據(jù)大部分的病毒聚合酶和與結(jié)構(gòu)蛋白競(jìng)爭(zhēng)，從而直接干擾后者的復(fù)制[22]。近年來(lái)有研究證明，SeV、RSV、VSV、狂犬病病毒和流感病毒中含有的DI病毒粒子都分別能干擾正常完整結(jié)構(gòu)病毒的增殖，使正常病毒的復(fù)制降低[23-24]。Timo Frensing等研究者分析了流感病毒感染MDCK細(xì)胞后DI病毒對(duì)病毒復(fù)制的影響，發(fā)現(xiàn)PB2缺陷的DI病毒可干擾流感病毒的復(fù)制，并且其缺陷基因的RNA主要影響病毒復(fù)制的第二步-合成子代病毒粒子vRNA，從而影響細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗的質(zhì)量[25]。

2.2 刺激宿主的抗病毒免疫反應(yīng) 大量研究表明，DI病毒能夠刺激感染后的細(xì)胞激活抗病毒反應(yīng)，產(chǎn)生干擾素，其中SeV的Cantell亞型是研究缺陷病毒相關(guān)干擾素反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)，被用于副黏病毒科病毒在體內(nèi)體外免疫刺激的研究[7，26-27]。DI病毒粒子能夠刺激模式識(shí)別受體，包括Toll likE-receptors (TLRs)、RIG-I like receptors (RLRs) 和melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA5)[28-29]。當(dāng)缺陷病毒被RLRs識(shí)別后，激活了下游的IRF3和NF-kB，繼而引起I型和III型干擾素、炎性細(xì)胞因子和干擾素刺激基因ISGs，如ISG54、 ISG56和 RSAD2的表達(dá)。當(dāng)ISGs在被感染細(xì)胞內(nèi)抑制病毒時(shí)，干擾素又通過(guò)自分泌和旁分泌影響著周圍的細(xì)胞以及遠(yuǎn)端組織的抗病毒反應(yīng)[30]。炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，如 IL-6、TNF-α和 IL-1β，又促進(jìn)著炎癥和先天性免疫到適應(yīng)性免疫的過(guò)渡。在流感病毒中，NS1蛋白為非結(jié)構(gòu)蛋白，是基因組片段中最短的，主要編碼NS1蛋白和NS2蛋白。NS2蛋白又稱核輸出蛋白，主要在感染晚期出現(xiàn)，存在于成熟病毒粒子中，參與核糖核蛋白復(fù)合物的核質(zhì)輸出，具有三大主要功能，包括其在感染早期，可與宿主模式識(shí)別受體中的RIG-1結(jié)合形成拮抗體，阻斷下游IRF信號(hào)通路，抑制干擾素的產(chǎn)生，是病毒在早期感染中逃避先天性免疫反應(yīng)的主要因素之一。Jihye Lee 等研究者在體外條件下KG11毒株會(huì)產(chǎn)生可表達(dá)分子量為13.2 kD的缺陷型NS1蛋白[31]。相比于全長(zhǎng)型NS1蛋白，缺陷型NS1蛋白能夠刺激感染細(xì)胞激活抗病毒反應(yīng)，產(chǎn)生干擾素，從而干擾病毒的復(fù)制并使其毒力減弱。目前還有研究證明，缺失部分PB2基因后的缺陷病毒能夠編譯一個(gè)小分子蛋白，這個(gè)新生成的小分子蛋白能夠與抗病毒反應(yīng)信號(hào)通路上的MAVs作用，從而誘導(dǎo)I型干擾素反應(yīng)[32]。

3 檢測(cè)方法

對(duì)于DI病毒的檢測(cè)，對(duì)其定性時(shí)qPCR和基因序列的分析為常規(guī)、易操作的檢測(cè)方法。首先是通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察其病毒RNA或cDNA，緊接著測(cè)序來(lái)檢測(cè)DI病毒片段[8]。在對(duì)其進(jìn)行定量時(shí)，主要采用的是實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，該方法是利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析，從而可計(jì)算得到模板拷貝值，但是也存在一定的缺點(diǎn)，例如其擴(kuò)增效率具有引物依賴性、需要標(biāo)準(zhǔn)曲線等。為了克服這些缺陷，有學(xué)者建立了反轉(zhuǎn)錄微滴式數(shù)字PCR法(ddPCR)，它是一種用于檢測(cè)缺陷型干擾粒子的新方法[33]。ddPCR的原理是：在傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增前對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理，即采用Bio-Rad QX200 ddPCR這個(gè)平臺(tái)，應(yīng)用微流體技術(shù)將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成數(shù)萬(wàn)個(gè)納米級(jí)的微滴，其中每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶分子，或含1個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸分子。經(jīng)PCR擴(kuò)增后對(duì)每個(gè)微滴的熒光信號(hào)逐一分析，有熒光信號(hào)的微滴判讀為1，無(wú)熒光信號(hào)的微滴判讀為0，微流體設(shè)備中的掃描裝置可計(jì)算陽(yáng)性和陰性微滴，并根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴個(gè)數(shù)與比例即可精確得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。該方法克服了qPCR的一些缺陷，比如不依賴于擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值(Ct)、不受擴(kuò)增效率影響和不需標(biāo)準(zhǔn)曲線等，具有良好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。Samantha L. Schwartz等研究者在檢測(cè)缺陷流感病毒時(shí)就通過(guò)對(duì)這兩種方法的比較來(lái)進(jìn)一步證實(shí)了ddPCR法的優(yōu)勢(shì)[33]。相比于qPCR法僅限于進(jìn)行不同病毒間相同DI病毒片段的比較，ddPCR檢測(cè)法不僅可進(jìn)行不同病毒間相同DI病毒片段的比較，也可進(jìn)行同一病毒間不同DI病毒片段的比較。該研究認(rèn)為ddPCR檢測(cè)法具有高度的靈敏性和較低的變異系數(shù)，可精確測(cè)定每個(gè)樣品中模板的拷貝值，實(shí)現(xiàn)真正意義上的絕對(duì)熒光定量，有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)缺陷病毒的精確測(cè)定以及毒株的質(zhì)量化控制。

4 DI病毒的抗病毒臨床應(yīng)用

DI病毒由于其不具感染性和激活宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力，吸引了大量科研工作者對(duì)其臨床抗病毒功能進(jìn)行了研究。DI 病毒對(duì)VSV和猿猴空泡病毒SFV感染小鼠均有一定的保護(hù)作用，而這種保護(hù)作用可能與I型干擾素的分泌有關(guān)。大量的研究證實(shí)在小鼠感染A型流感病毒后，如果其中含有高濃度的缺陷病毒，小鼠體內(nèi)病毒的含量以及免疫損傷都有所降低[34]。最新研究表明，通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù)重組PR8-H1N1 DI病毒在體內(nèi)體外均有良好的抗病毒效果，并且還對(duì)B型流感病毒感染具有交叉免疫保護(hù)作用。其中，244 DI病毒在致死性流感病毒感染小鼠中具有良好的保護(hù)作用。該DI病毒來(lái)源于流感病毒的PB1片段，通過(guò)反向遺傳技術(shù)嵌入到A/PR/8/34流感病毒而得到[35]。在對(duì)小鼠滴鼻注射H1N1/H2N2/H3N2或H3N8病毒前或同時(shí)間滴鼻給予244 DI病毒，能夠顯著減輕感染小鼠的臨床癥狀，并且該244 DI病毒對(duì)于感染后的治療也具有明顯的效果。244/PR8不具有毒性并且不會(huì)產(chǎn)生臨床副作用，其注射過(guò)程也不會(huì)具有感染性。注射244/PR8病毒會(huì)對(duì)不同品系、不同年齡階段的小鼠均產(chǎn)生保護(hù)作用。通過(guò)對(duì)患有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病小鼠的感染研究，證實(shí)了獲得性免疫應(yīng)答雖然不能起到保護(hù)作用但是能夠有效的清除病毒。DI病毒能夠促使干擾素聚集在呼吸道，能夠?qū)Ξ愒葱院粑啦《救鏐型流感病毒、副黏病毒、肺炎病毒等感染的小鼠提供保護(hù)作用，因此DI病毒可作為抗流感治療的潛在的有效的新途徑[36]。由于DI病毒的生物學(xué)特性，使用蔗糖密度離心法也成為分離DI病毒的一種方法，例如缺陷型水泡性口炎病毒。水泡性口炎病毒屬于彈狀病毒，通過(guò)其基因組大小的不同可將其DI病毒從完整型病毒中分離出來(lái)[37]。對(duì)于脊髓灰質(zhì)炎病毒或呼腸孤病毒，DI病毒和標(biāo)準(zhǔn)病毒粒子的生物學(xué)特性差異很小，因此需要更為靈敏的方法才能檢測(cè)到DI病毒，例如脊髓灰質(zhì)炎病毒和其DI病毒可通過(guò)氯化銫梯度離心法分離出[37]。雖然這種方法較為容易的分離出純DI病毒，但是并不適用于所有類型的病毒，例如流感病毒。由于流感病毒的DI病毒和完整型病毒的尺寸大小差異很小，故蔗糖密度離心法不能有效的進(jìn)行分離，因此研究者在分離缺陷流感病毒的過(guò)程中更多采用的是反向遺傳技術(shù)[38]。

5 總結(jié)與展望

DI病毒在許多病毒中的廣泛出現(xiàn)證實(shí)了它們?cè)趧?dòng)物病毒生物學(xué)方面的重要性，它們核苷酸的缺失以及干擾素活性可在病毒生長(zhǎng)調(diào)控方面具有重要的作用。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)的生物化學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生物學(xué)研究認(rèn)為，DI病毒對(duì)疾病可產(chǎn)生良好的預(yù)防和控制效果，特別是人獸共患病，比如A型流感病毒。目前，防控禽流感的方法主要為抗流感藥物的使用和疫苗接種。然而，疫苗接種存在一定的局限性，雖然在實(shí)踐中應(yīng)用了一些已研發(fā)出的疫苗，但是流感病毒所具有的抗原漂移和抗原變異的特點(diǎn)使其毒株不斷地變化，從而使疫苗不能有效的對(duì)抗其發(fā)生變異的毒株。因此，探尋新的抗病毒方法迫在眉睫。DI病毒的良好的抗病毒效果使其成為潛在的免疫佐劑用于疾病中。未來(lái)，隨著DI病毒的不斷深入研究，使其可以應(yīng)用的更多的疾病防控中，具有廣闊的應(yīng)用和發(fā)展前景。