楊國麗

（遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110164）

禽白血病病毒（avian leukemia virus，ALV）是引起家禽腫瘤性疾病的三種主要病原之一，屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科正反轉(zhuǎn)錄病毒亞科α反轉(zhuǎn)錄病毒屬的成員。ALV成員眾多，不同毒株間生物學(xué)特性存在差異。根據(jù)ALV在不同遺傳型雞胚成纖維細(xì)胞上的宿主范圍、囊膜糖蛋白抗原結(jié)構(gòu)和各個(gè)病毒亞群成員之間的干擾模式的差異，將ALV分為A-K共11個(gè)亞群，其中A、B、C、D、E、J和K 7個(gè)亞群[1-2]可感染雞。E亞群病毒是內(nèi)源性病毒，所謂的內(nèi)源性病毒是指能整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體并按著孟德爾遺傳規(guī)律垂直傳播給子代的ALV，內(nèi)源性ALV通常無致病性或致病性很弱；而A、B、C、D、J和K是外源性病毒，不能通過宿主細(xì)胞染色體傳播，致病力強(qiáng)，傳染性強(qiáng)。

獸醫(yī)臨床上所見到的AL多是由A、B、J亞群ALV引起的，近幾年來，我國學(xué)者又從我國獨(dú)有的一些地方品系雞中分離到了一個(gè)新的ALV亞群——K亞群白血病病毒。經(jīng)典的AL主要是A、B亞型病毒感染引起3月齡以上蛋用型雞發(fā)生經(jīng)典的淋巴細(xì)胞瘤，C、D亞群病毒感染引起的腫瘤在臨床上很難見到；E亞群病毒分布在除特殊培育的專門品系雞群之外的所有雞只中；J亞群主要引起髓樣細(xì)胞瘤，其致病性和傳染性均強(qiáng)于其他亞群，目前在我國已成為AL主要流行亞群，部分復(fù)制缺陷性并攜帶有腫瘤基因的J亞群病毒感染雞群后可引起急性型腫瘤的發(fā)生，已有關(guān)于30余日齡商品肉雞發(fā)生J亞群白血病的報(bào)道；K亞群病毒只在我國地方品種保種雞群中鑒定出來，致病性和傳染性相對低一些，K亞群的毒株在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)生長復(fù)制慢，p27抗原含量低，在進(jìn)行p27抗原檢測時(shí)容易漏檢，應(yīng)特別注意。水平和垂直傳播是AL傳播的特性，以垂直傳播為主，水平傳播在雛雞出殼時(shí)或在出雛箱內(nèi)是最為常見的。雞群感染ALV后導(dǎo)致感染雞發(fā)育緩慢、產(chǎn)蛋下降甚或發(fā)生血管瘤，病雞漸進(jìn)性消瘦，臨床表現(xiàn)為內(nèi)臟器官等組織器官發(fā)生惡性腫瘤等惡病質(zhì)，并且ALV感染會導(dǎo)致免疫抑制，ALV所造成的免疫抑制僅次于網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒。

ALV一般抵抗力不強(qiáng)，普通的消毒劑即可將其殺滅，且該病毒對熱較為敏感，高溫下極易滅活，但該病的防治依然面臨著巨大的困難[3]?，F(xiàn)將一例16日齡肉仔雞發(fā)生急性J亞群AL病例的診斷情況報(bào)告如下。

1 基本情況

2017年3月13日，養(yǎng)殖戶從孵化場購進(jìn)26 000只1日齡商品肉雞雛，采用“全進(jìn)全出”的籠養(yǎng)方式進(jìn)行飼養(yǎng)。從13日齡起雞雛陸續(xù)出現(xiàn)萎靡等癥狀，病雞主要表現(xiàn)為閉眼、呆立、縮頸、體型消瘦、雞冠蒼白和關(guān)節(jié)腫脹等臨床癥狀，發(fā)病率約在2%左右，至4月5日就診前累計(jì)死淘500多只。該批次雞雛已按程序免疫新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎和法氏囊疫苗，聯(lián)合應(yīng)用抗病毒和抗細(xì)菌藥治療均無效。該養(yǎng)殖場周邊3個(gè)養(yǎng)雞場尚無疫病發(fā)生。

2 剖檢變化

剖檢可見病雞肩關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)有腫瘤結(jié)節(jié)，內(nèi)容物為灰白色滲出液，肝臟腫大暗紅，表面可見有針尖至粟粒大白色腫瘤結(jié)節(jié)，心肌和腸管有白色瘤狀物，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查和剖檢的病理變化初步診斷為腫瘤性疾病，詳見圖1。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1細(xì)菌學(xué)檢測無菌采集病雞肝、心、脾和關(guān)節(jié)滲出液樣品分別接種于普通瓊脂、麥康凱瓊脂、血瓊脂、SS培養(yǎng)基和TCLS培養(yǎng)基于37℃溫箱培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24 h和48 h觀察結(jié)果，各培養(yǎng)基上均未見細(xì)菌生長。樣品涂片，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢未見典型細(xì)菌。

3.2組織病理學(xué)檢測采集病雞肝臟、心肌和腸管病健交界部位進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，在10×80倍光鏡下觀察可見肝臟、心臟、腸管正常組織萎縮，髓樣細(xì)胞瘤發(fā)育階段一致，呈彌散性分布，由淋巴細(xì)胞形成血管套，并伴有淋巴細(xì)胞浸潤性增生，詳見圖2。

3.3血清學(xué)檢測取送檢的15份雛雞血清進(jìn)行以下檢測。

3.3.1 AB亞群抗體ELISA檢測 用愛德土ALV AB亞群抗體檢測試劑盒進(jìn)行ELISA檢測15份血清，結(jié)果均為陰性。

3.3.2 J亞群抗體ELISA檢測 用愛德土ALV J亞群抗體檢測試劑盒進(jìn)行ELISA檢測15份血清，結(jié)果均為陽性。

3.3.3 雞白痢平板凝集試驗(yàn) 用哈爾濱動物生物制品國家工程研究中心有限公司的白痢平板凝集試驗(yàn)檢測試劑進(jìn)行雞白痢抗體檢測15份血清，結(jié)果均為陰性。

3.4病原學(xué)檢測

3.4.1 ALV P27抗原ELISA檢測 用愛德土禽白血病抗原檢測試劑盒進(jìn)行ELISA檢測肉雛雞15份血清

和15份泄殖腔棉拭子樣品，結(jié)果均為陽性。

3.4.2 熒光RT-PCR檢測 被檢樣品：無菌采集病雞肝、心、脾和關(guān)節(jié)滲出液樣品混合成1份樣品，用禽白血病熒光RT-PCR進(jìn)行檢測，結(jié)果陽性，詳見圖3。

3.4.3 普通RT-PCR檢測 引物片段由青島易邦生物工程有限公司提供。對樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，被檢樣品同3.4.2。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，變性5 min；94℃30 s，56℃30 s；72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。結(jié)果AB亞群均為陰性；J亞

群AL為陽性，條帶在800 bp左右，與預(yù)期大小相符，見圖4。

圖1 剖檢變化Fig.1 Autopsy change

圖2 組織病理學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果Fig.2 Histopathological microscope was used to observe the results

圖3 熒光RT-PCR陽性曲線Fig.3 Fluorescence rt-pcr positive curve

圖4 電泳條帶圖Fig.4 Electrophoresis strips

綜上，從臨床癥狀、組織病理學(xué)檢查、血清學(xué)和病原學(xué)檢測的結(jié)果，綜合診斷為此養(yǎng)殖戶發(fā)生的疫情由J亞群AL導(dǎo)致。

4 防治措施

疫病確診后，立即建議養(yǎng)殖戶淘汰掉雞群中所有的病弱雞，適當(dāng)提高舎溫，每天加強(qiáng)對雞群的巡視，連續(xù)7 d實(shí)行日消毒管理，雞群穩(wěn)定后改為每周消毒2～3次，并及時(shí)進(jìn)行新城疫和禽流感的加強(qiáng)免疫，在飲水中添加多維連續(xù)7 d，并全群投給抗菌藥物和提高免疫力的藥物5 d。采取這些措施后，雞群基本穩(wěn)定下來。由于采取及時(shí)發(fā)現(xiàn)及時(shí)淘汰的措施，雞只因發(fā)生腫瘤而引起的的死亡得到控制，出欄時(shí)雞只成活率95%，但雞群采食量低、藥費(fèi)成本高，死淘率依然偏高，因本病繼發(fā)感染所致死淘率超過3%。出欄時(shí)平均體重2.1 kg左右，因本病造成的直接死亡率約在2%左右。

J亞群AL不僅造成一定死亡率，更能導(dǎo)致免疫抑制和繼發(fā)反應(yīng)，進(jìn)而嚴(yán)重影響生產(chǎn)性能。急性致腫瘤性ALV病程短，給J亞群AL的防控提出了更大的難題，對該病的防控任重而道遠(yuǎn)。

5 小結(jié)與討論

對ALV的防控最根本的途徑是實(shí)現(xiàn)種源凈化，在國內(nèi)外有很多這樣的先例，這就要求種禽企業(yè)必須承擔(dān)起主體責(zé)任，與相關(guān)的技術(shù)技術(shù)部門大力協(xié)作，經(jīng)過數(shù)個(gè)世代的嚴(yán)格檢測淘汰，是可以實(shí)現(xiàn)種禽凈化的。進(jìn)行種禽凈化以防止ALV的垂直傳播和孵化出雛時(shí)的水平傳播。J亞群ALV是ALV家族中重要的成員之一，在外源性的ALV中，J亞群病毒致病性和傳染性都是最強(qiáng)的。自1987年J亞群AL被發(fā)現(xiàn)以來，其流行的范圍迅速擴(kuò)大，曾一度給世界肉雞飼養(yǎng)業(yè)造成慘重的損失。J亞群在我國發(fā)生過兩次大的流行，20世紀(jì)90年代后期，學(xué)者們在我國發(fā)生ALV的肉種雞群中分離到該病毒，證實(shí)了J亞群AL已在我國流行，當(dāng)時(shí)肉用型雞群感染較為普遍，隨后各大肉雞育種公司加強(qiáng)了該病的凈化，很快使該病在肉雞中的流行得到了控制，但J亞群AL在我國的流行并沒有停止，J亞群ALV在選擇的壓力下，其基因組的變異速率加快，尤其是囊膜基因的突變，導(dǎo)致了病毒宿主范圍的擴(kuò)大，不僅擴(kuò)大到蛋雞，而且在我國的地方品種雞的感染也非常普遍。2008～2009年J亞群AL在我國蛋雞群中大暴發(fā)，每年大約有6 000萬只蛋雞由于J亞群AL感染發(fā)病死亡或被淘汰，養(yǎng)殖者們損失慘重[4]，隨著凈化工作的有效展開，該病在蛋雞中的流行已被有效控制。根據(jù)ALV感染雞后誘發(fā)腫瘤病程的長短，可將ALV分為兩類，即急性致瘤性ALV和慢性致瘤性ALV。急性致瘤性ALV其本身是復(fù)制缺陷性病毒，缺少基因組中g(shù)ag、pol和/或env基因的部分或全部，取而代之的是腫瘤基因。這類病毒感染雞后，在輔助病毒的協(xié)同下，經(jīng)2～3周就可誘發(fā)雞產(chǎn)生肉眼可見的腫瘤，而J亞群AL的部分毒株就是這類毒株，本案例是由急性致瘤性J亞群AL感染導(dǎo)致的急性AL。

在對AL進(jìn)行診斷或凈化時(shí)，單純的血清p27抗原檢測并不理想，假陽性率高，無法區(qū)分內(nèi)源性和外源性病毒感染。需要對檢測陽性結(jié)果的樣本進(jìn)行測序或者是結(jié)合特異性的核酸探針作分子雜交檢測。最理想的診斷方法是采血進(jìn)行病毒的分離，這是對AL進(jìn)行診斷的“黃金”方法，但分離病毒時(shí)操作程序繁瑣、需要在專門的實(shí)驗(yàn)室由經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)人員來操作細(xì)胞系，技術(shù)性強(qiáng)，并且歷時(shí)較長。大量的實(shí)踐表明，檢測種蛋蛋清和初生雛雞胎糞p27抗原與病毒分離方法的吻合性高；另外在雛雞出殼后的36～48 h，雛雞血清中ALV抗體與其親代的抗體水平有很高的平行性，可采用適時(shí)檢測雛雞抗體的方法來初步判定雛雞是否有垂直傳播感染ALV的可能性。在本案例中，由于其他原因沒有獲得該批商品肉雞親代的種蛋，也沒能采集到初生雛雞的胎糞，這是一個(gè)遺憾。

ALV感染雞群導(dǎo)致免疫抑制作用僅次于網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒。在進(jìn)行腫瘤的病例組織學(xué)檢查時(shí)，禽白血病的腫瘤細(xì)胞在顯微鏡下觀察，盡管細(xì)胞形態(tài)上有差異，但腫瘤細(xì)胞的發(fā)育階段是一致的，這是AL與雞馬立克病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒感染誘發(fā)腫瘤的主要區(qū)別。本案例中，在顯微鏡下可見髓樣細(xì)胞瘤都處于原始發(fā)育階段。結(jié)合流行病學(xué)、剖檢變化、血清學(xué)和病原學(xué)檢測，最終診斷為本次疫情是由J亞群禽白血病感染所誘發(fā)的急性腫瘤。

[1]QIU Y,LI X,FU L,et al.Development and characterization of monoclonal antibodies to subgroup A avian leucosis virus[J].Veterinary and Comparative Oncology,2014(1):47-51.

[2]顧玉芳，多婷，楊玉瑩，等.ALV-J HB2009株誘發(fā)雞白血病的致病性研究[J].中國家禽，2012（20）：52-54.

[3]葉建強(qiáng)，秦愛建，邵紅霞，等.J亞型ALV（ALV-J）ELISA檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006（3）：235-237.

[4]崔治中.禽白血病及其防控百問百答[J].中國家禽，2016，38（23）：72-74.