王方平 張平安 楊曉燕

430060武漢大學人民醫(yī)院檢驗科

固有免疫應答是機體抵抗病原微生物的第一道防線。細菌、病毒等病原微生物入侵機體后，其表面的病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）被機體內(nèi)的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識別，啟動固有免疫應答。PRR主要包括表達在細胞內(nèi)外的Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）家族，如 TLR3、TLR7 等；核酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域 NOD樣受體（nucleotidebinding oligomerization domain-like recepter，NLR），如NOD家族（NOD1-5）；以及維甲酸誘導基因Ⅰ樣受體家族（RIG-like receptors，RLRs），如維甲酸誘導基因Ⅰ（retinoic acid inducible geneⅠ）、黑色素瘤分化相關抗原5（melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5）等［1］。 這些 PRR 能夠識別不同的病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），如TLR4可以識別革蘭氏陰性菌脂多糖（lipopolysaccharides， LPS）［2］，RIG-Ⅰ識別 5′端帶有三磷酸基團的RNA（5′ppp-RNA）等，進而參與激活白細胞、基質(zhì)細胞以及活化B細胞、T細胞，刺激干擾素分泌等過程，在固有免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要的作用。慢性丙型肝炎患者體內(nèi)抗病毒能力下降，如RIG-Ⅰ基因及干擾素基因表達量顯著下降等［3］。

1 丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）

HCV歸屬于黃病毒科屬，是一種單股正鏈RNA病毒，于1989年首次被發(fā)現(xiàn)［4］，是急慢性肝炎的主要原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計全球大約有1.85億人感染HCV，占世界人口的3.2%，同時每年大約有300到400萬新發(fā)病例［5］。HCV有6種基因型，這些基因型中有70多種亞型，每種基因型感染人種不同，我國主要感染1b型、2 a型。HCV基因組長約9.6 kb，包括 5′和 3′非編碼區(qū)（noncoding region，NCR），5′非編碼區(qū)下游緊接一開放的閱讀框（open reading frame，ORF），其編碼一個約3 000個氨基酸長度的多聚蛋白前體，該前體可被宿主細胞或病毒自身蛋白酶裂解成十幾種蛋白質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)蛋白和六種非結(jié)構(gòu)蛋白［6］。結(jié)構(gòu)蛋白包括核心蛋白C，兩種包膜蛋白E1、E2和p7離子通道［7］。HCV核心蛋白具有許多功能，它與宿主細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導途徑相互作用。非結(jié)構(gòu)蛋白包括 NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，不僅在病毒復制中具有作用，而且在病毒的生活周期具有重要作用［7］。NS2、NS3具有蛋白水解酶活性，參與病毒多聚蛋白前體的切割，NS3蛋白還具有螺旋酶活性，參與HCV-RNA分子解螺旋，以協(xié)助RNA復制，NS4的功能尚不清楚，NS5A是一種磷酸蛋白，可以與多種宿主細胞內(nèi)蛋白相互作用，對于病毒的復制起重要作用［8］。而NS5B則具有RNA依賴的RNA聚合酶活性，參與HCV 基因組復制［8］。

在急性丙肝（acute viral hepatitis C，AHC）早期會出現(xiàn)病毒載量呈指數(shù)增加，但是隨后病毒的復制會得到抑制，這說明固有免疫系統(tǒng)具有抑制HCV的作用。然而，在感染的細胞中，HCV能抑制抗病毒效應蛋白的功能或表達，并且其細胞內(nèi)高水平的病毒載量和ISG共存［9］，說明干擾素誘導的抗HCV作用減弱或病毒發(fā)生了逃逸突變［10］。HCV能夠通過多種機制逃避宿主的免疫反應，NS3羧基端含DExD／H解旋酶活性，與 NS4A非共價結(jié)合形成NS3／4 A蛋白酶復合物，受 NS4A正調(diào)控，NS3／4 A蛋白酶復合物切割TLR3的下游信號分子TRIF，阻斷細胞內(nèi)IFN介導的抗病毒信號通路傳導，這是造成HCV持續(xù)感染的重要原因之一［11］；同時還能通過NS3／4 A蛋白酶復合物對MAVS C508位點進行水解，使其從線粒體脫落，阻止其下游信號分子的激活，從而阻斷賴氨酸信號通路，以逃避宿主的干擾素反應［12］；NS3／4 A、NS4B 蛋白顯著阻斷由 RIG-Ⅰ介導的 IFN-β 的產(chǎn)生［13］。

慢性HCV感染的一個特點是病毒特異性CD8T細胞在功能上受損，它們無法增殖或無法分泌抗病毒細胞因子，如IFN-γ［10］。慢性HCV感染患者外周血及肝臟內(nèi)Treg數(shù)量是健康人的3倍，這些Treg能以細胞與細胞間直接作用的方式抑制CD8＋T細胞的增殖和IFN-γ的分泌［14］。T細胞抗病毒能力下降主要與T細胞數(shù)量耗竭和病毒突變逃避免疫有關。有報道稱在慢性感染患者以及急性感染的患者體內(nèi)均存在病毒逃逸突變［9］，病毒突變與疾病的慢性化和病毒清除相關［15］。

也有證據(jù)表明病毒效應可能不是導致慢性肝病的直接原因，病毒感染或酒精濫用導致的慢性肝病晚期階段患者對病原微生物感染表現(xiàn)出更高的易感性被認為是宿主免疫受損的原因之一。有研究表明抗病毒治療是慢性肝炎發(fā)展為原發(fā)性肝癌的相關因素［16］，因此積極的抗病毒治療是延緩丙型肝炎慢性化進展及發(fā)展為肝癌的有效手段。

2 RIG-Ⅰ

RIG-Ⅰ能識別5′端帶有三磷酸基團的RNA（5′ppp-RNA），5′ppp-RNA是 RNA病毒復制過程中產(chǎn)生的過渡型RNA。RIG-Ⅰ能特異性識別處于復制階段的HCV RNA病毒，啟動免疫應答，在固有免疫和獲得性免疫中具有重要的作用。RIG-Ⅰ基因又稱為DDX58 A首先由Choo等［4］在視網(wǎng)膜母細胞瘤易感基因（Rb-）缺陷小鼠中被篩選出，其表達模式隨后在小鼠后腦和脊髓中簡要闡述，主要表達在非免疫細胞內(nèi)。人類RIG-Ⅰ基因位于染色體9p12，基因約長3.0 Kb，其編碼一段925個氨基酸的殘基。RIG-Ⅰ蛋白由N端、中間端和C端構(gòu)成，其中N端包括半胱氨酸蛋白酶激活和募集結(jié)構(gòu)域（caspase activation and recruitment domain，CARD）；中間端為RNA解旋酶區(qū)；C端為抑制區(qū)（repressor doman，RD）［5］。RIG-I蛋白通過CARD結(jié)構(gòu)域與接頭蛋白CARD結(jié)構(gòu)域相互作用激活下游通路，當細胞中CARD過表達時可誘導IFN產(chǎn)生；RNA解旋酶區(qū)即DExD／H區(qū)包括解旋酶TAS基序和ATP結(jié)合基序兩部分，ATP結(jié)合基序位于K270附近，其突變與RIG-Ⅰ功能障礙有關；RD結(jié)構(gòu)區(qū)主要識別病毒RNA，調(diào)控 RIG-Ⅰ下游信號通路［5］。 在靜息狀態(tài)下，RIG-Ⅰ受體處于自抑狀態(tài)，CARD結(jié)構(gòu)域和RD抑制區(qū)通過分子內(nèi)相互作用處于非活化狀態(tài)。一旦病毒入侵，RIG-Ⅰ能識別病毒RNA，首先激活ATP水解，釋放能量解除其自身抑制構(gòu)象，暴露CARD結(jié)構(gòu)域，與信號分子線粒體抗病毒信號傳送蛋白（Mitochondrial Antiviral Signaling Protein，MAVS，又稱為VISA／IPS-1／Cardif）CARD相互作用招募下游信號分子，激活干擾素刺激因子3（IFN regulatory factor-3，IRF-3）和核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）效應基因。該反應由控制RIG-Ⅰ多聚化和MAVS相互作用的內(nèi)部抑制區(qū)RD調(diào)節(jié)［6］。

自從2004年RIG-Ⅰ作為細胞內(nèi)病毒RNA識別受體被發(fā)現(xiàn)以來［7］，關于RIG-Ⅰ蛋白及其活化的機制有較多研究。RIG-Ⅰ的活化需要以下步驟：配體結(jié)合，構(gòu)象變化，易位至線粒體，寡聚化，翻譯后修飾以及與MAVS相互作用。其活性主要通過多種蛋白質(zhì)翻譯后修飾（post-translational modification，PTM），如泛素化、乙?；?、酰胺化、ISG化、SUMO化或復雜的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)非共價結(jié)合相互作用［8］。這種復雜的調(diào)節(jié)機制主要是確保病毒感染期間及感染后機體內(nèi)抗病毒能力處于適當水平。RIG-Ⅰ的負性和正性調(diào)節(jié)因子可以被病毒或IFN激活，產(chǎn)生復雜的反饋回路，在該環(huán)路中RIG-Ⅰ活性及含量與IFN產(chǎn)生密切相關。

2.1 蛋白激酶介導RIG-Ⅰ磷酸化 蛋白激酶通過催化蛋白磷酸化作用控制細胞生命活動，已知酪蛋白激酶 II（CKII）和蛋白激酶 C-α／β（PKCα／β）能介導 RIG-Ⅰ磷酸化［9］，其中 CKII介導 RIG-Ⅰ上的蘇氨酸770和絲氨酸854／855磷酸化以維持自身抑制狀態(tài)［10］，PKC 介導 RIG-Ⅰ上的蘇氨酸170 和絲氨酸8殘基磷酸化，從而抑制RIG-Ⅰ與三結(jié)構(gòu)域蛋白家族25（tripartite motif 25，TRIM25）或 MAVS 的相互作用［9］。病毒感染后，與MAVS結(jié)合，TRIM25介導泛素化導致磷酸蛋白酶1（PP1-α／γ）異構(gòu)體與RIG-I相互作用脫磷酸化［11］，核因子 κB 激酶抑制劑（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase EpsilonI，KK-κB）介導干擾素調(diào)節(jié)因子3／7活化，從而抑制RIG-ⅠRD區(qū)絲氨酸 855 磷酸化，抑制 RIG-Ⅰ信號傳導［12］。

2.2 泛素化介導的RIG-Ⅰ降解 RIG-Ⅰ信號通路激活的同時可以促進RIG-Ⅰ蛋白的降解，從而限制過量激活的RIG-Ⅰ信號傳導，平衡總的抗病毒活性。泛素-蛋白酶體（uibiquitin-proteasome system，UPS）是真核生物內(nèi)蛋白選擇性降解的途徑之一，其中泛素是一個由76氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì)，主要通過多聚泛素化鏈發(fā)生作用；蛋白酶體是泛素-蛋白酶系統(tǒng)的主要組成部分，主要負責識別并降解K48泛素鏈標記的蛋白底物［13］。RIG-Ⅰ通過多個E3連接酶被K48所標記，導致其能被蛋白酶體識別并降解。泛素連接酶125（RNF125）誘導K48在RIG-ⅠN端泛素化從而抑制 RIG-Ⅰ信號通路［14］。一旦RIG-Ⅰ被聚肌胞苷酸（polyI：C）激活，RNF125 的表達反饋性上調(diào)，這說明RIG-Ⅰ信號通路的激活同時可以促進RIG-Ⅰ降解，限制過量的信號傳導，平衡總的抗病毒能力［14］。K63泛素鏈主要參與多種細胞內(nèi)的信號通路，它通過標記底物蛋白，使之被特異的調(diào)控因子識別，激活下游信號通路。TRIM25與RIG-Ⅰ相互作用并催化RIG-Ⅰ的賴氨酸172上的K63 多聚泛素化［15］。

3 RIG-Ⅰ在丙型肝炎患者介導的信號傳導通路

目前已知各種RNA病毒家族，如副粘病毒科、彈狀病毒科、正粘病毒科、絲狀病毒科、沙粒病毒科、布尼亞病毒科、黃病毒科、冠狀病毒科和杯狀病毒科均可激活RIG-Ⅰ［5］。將HCV RNA轉(zhuǎn)染到肝癌細胞后可以瞬時活化IRF3和IFN-β，但是在RIG-Ⅰ功能性缺乏的細胞中卻未得到相同結(jié)果，這表明RIG-Ⅰ是HCV感染細胞后激活IRF3的關鍵受體［17］。RIG-Ⅰ主要識別 HCV 3′非編碼區(qū)（3′-noncoding region，3′NCR），該區(qū)在HCV基因組中高度保守，并且是HCV復制的關鍵。3′NCR由三部分組成，包括含有2個莖環(huán)的可變區(qū)、單鏈多聚U富集區(qū)和含有3個莖環(huán)保守的“X”區(qū)，5′ppp帽端是激活 RIG-Ⅰ信號通路必需的條件，但是多聚 U／UC 區(qū)域才是關鍵因素［18］。 RIG-Ⅰ的C端RD結(jié)構(gòu)域中帶正電荷結(jié)合區(qū)能結(jié)合5′ppp-RNA，該結(jié)合區(qū)只能容納3個核苷酸，RIG-Ⅰ利用解旋酶域來區(qū)分特異性RNA序列［19］。

最近，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的干擾素基因刺激物（STING），被認為是 RIG-Ⅰ信號傳導的激活劑。STING基因缺陷小鼠極易感染皰疹性口腔炎病毒（vesicular stomatitis virus，VAS），然而在缺乏 STING基因下利用合成dsRNA刺激細胞產(chǎn)生干擾素的能力并不受影響［20］。關于STING基因如何激活下游IRF-3和 NF-κB的具體機制不清楚，但據(jù)報道稱STING可以通過與一種八聚體復合物exocyst結(jié)合，將其以囊泡的形式分泌從而激活下游信號通路［21］。黃病毒NS4B具有與STING的同源結(jié)構(gòu)域，并與NS4B共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，NS4B能阻斷STING與MAVS 相互作用，抑制 IFN-β 產(chǎn)生［22］。

目前有關RIG-Ⅰ在抗病毒信號通路和干擾素誘導作用的報道較多［22-23］。 Weber 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染了甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）RNA的細胞中，RIG-Ⅰ能識別IAV RNA，并通過干擾素依賴方式抑制IAV復制。Sato等［24］在研究乙肝患者的免疫應答時也發(fā)現(xiàn)，RIG-Ⅰ可以阻礙HBV聚合酶與5，-ε區(qū)域的相互作用，直接抑制 HBV復制。這些發(fā)現(xiàn)為研究固有免疫系統(tǒng)中模式識別受體RIG-Ⅰ提供了新的思路和方向。但是關于RIG-Ⅰ在CHC患者體內(nèi)是否同樣能抑制HCV復制，以及其具體機制是怎樣的報道較少，有研究推測RIG-Ⅰ上游一些調(diào)節(jié)蛋白，可能在RIG-Ⅰ直接抑制病毒復制中發(fā)揮著重要作用［25］，目前仍需進一步分子機制方面的研究來闡明這些疑問。

4 結(jié)語

RIG-Ⅰ是識別HCV RNA病毒的重要的模式受體之一，它不僅能依賴MAVS銜接蛋白激活固有免疫應答誘導干擾素產(chǎn)生發(fā)揮抗病毒作用，還能調(diào)節(jié)適應性免疫應答?；趯@些分子機制的不斷深入了解，有望通過靶向調(diào)控RIG-Ⅰ信號通路為治療和控制HCV病毒感染、甚至控制炎癥反應和治療自身免疫性疾病提供新的思路和策略。

利益沖突 無