李 剛，許 波，梁學振，蓋帥帥，夏聰敏，閻博昭，李嘉程

(山東中醫(yī)藥大學 1.骨科教研室、2. 第一臨床醫(yī)學院、3. 中醫(yī)學院，山東 濟南 250355)

隨著世界人口的老齡化，骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)的發(fā)病率也逐年上升，現(xiàn)已成為世界普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[1]。OP是一種以骨量及骨組織微結(jié)構(gòu)異常為特征的代謝性骨病[2]，可能導致骨脆性增加和增加骨折的風險，對中老年人的健康構(gòu)成嚴重威脅[3]。目前，治療OP的公認藥物主要包括骨吸收抑制劑、骨形成促進劑、骨礦化物等三大類。但從藥物相關(guān)的治療效果來看，目前僅僅局限于改善臨床癥狀、延緩病情進展，卻不能使OP患者的骨重塑過程重新達到平衡狀態(tài)，以發(fā)揮逆轉(zhuǎn)病情甚至治愈的效果；同時，上述藥物的靶向性均不強，因此亟需尋找新的思路解決這一問題[4]。中藥及其復方治療OP以溫補腎陽、強筋壯骨、填精生髓為主，兼以益氣養(yǎng)血、祛風散寒除濕、通絡(luò)止痛。現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)[5]，此類中藥及其復方具有提高腸鈣吸收、促進成骨細胞礦化、增強細胞成骨性活性、抑制破骨細胞的形成等綜合功效。因此，中藥及其復方在防治OP方面具有獨特優(yōu)勢和廣闊發(fā)展前景。

淫羊藿是中醫(yī)臨床抗骨質(zhì)疏松常用藥物，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效。研究證實，淫羊藿對于OP具有較好的臨床療效，能夠明顯改善OP癥狀、延緩甚至逆轉(zhuǎn)OP的進程[6]，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機制至今尚不明確。因此，分析淫羊藿的有效活性成分、作用靶點及其可能的作用機制，有利于闡述淫羊藿的科學內(nèi)涵，并促進其臨床推廣應(yīng)用。目前，現(xiàn)有的研究手段在針對中藥及其復方研究方面往往存在檢測靈敏度低、可靠評價指標少等問題，以至于難以科學、有效、全面地闡釋中藥及其復方的作用機制。

基于系統(tǒng)生物學理論的建立，網(wǎng)絡(luò)藥理學為研究中藥及其復方潛在活性成分和作用靶點提供了有效的研究策略。本文針對中藥單體淫羊藿中所有已報道的成分，通過藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、藥物相似性(drug-likeness，DL)等方面進行系統(tǒng)的篩選，進而預(yù)測可能入血的有效活性成分，同時配合化合物相似性片分析和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析的手段，進一步預(yù)測淫羊藿治療OP的作用靶點，對靶點進行富集分析，探討其可能的作用機制。流程圖見Fig1。

1 方法

1.1淫羊藿中活性成分的篩選和靶點預(yù)測中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)作為國內(nèi)相對比較完善的中藥成分靶點數(shù)據(jù)庫，收錄了中藥約505味，相關(guān)中藥成分約為12 144個，同時對每個成分毒藥物動力學(absorption and distribution and metabolism and excretion, ADME)參數(shù)進行了詳細的描述，例如OB、DL、Caco-2細胞滲透性、半衰期、血腦屏障、脂水分布系數(shù)等。本研究通過檢索TCMSP，對淫羊藿所有成分數(shù)據(jù)庫進行了篩選及構(gòu)建，其中篩選條件為 OB≥30%，DL≥0.18。同時，結(jié)合前期研究結(jié)果，將獲取的活性成分與文獻比對，并采用 TCMSP 靶點預(yù)測模型對相關(guān)活性成分作用靶點加以預(yù)測。

1.2淫羊藿“活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)”構(gòu)建淫羊藿“活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)”主要通過網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件 Cytoscape 3. 2. 1進行構(gòu)建和分析。本研究將從上述獲得的活性成分及靶點關(guān)系進行導入以完成相關(guān)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，其中用“節(jié)點”(node)表示分子、靶蛋白，用“邊”(edge)表示成分與靶點之間的關(guān)系；然后采用network analyzer插件進行網(wǎng)絡(luò)特征分析，以明確淫羊藿中較為重要的成分和靶點，同時跟蹤文獻以分析其中的相互作用。

1.3GEO芯片數(shù)據(jù)分析OP相關(guān)靶點從GeneExpression Omnibus數(shù)據(jù)庫中下載編號為：GSE7429的芯片數(shù)據(jù)原始文件，該芯片數(shù)據(jù)的原始文件包含了20個人的血液樣本，主要針對絕經(jīng)后骨密度(bone mineral density, BMD)高低不同女性血液的基因表達譜的基因測序(10個低BMD、10個高BMD)，進行了基因測序。本研究利用robust multiarray average(RMA)算法對其原始文件進行了背景校正和矩陣數(shù)據(jù)歸一化處理，同時采用limma包對芯片數(shù)據(jù)進行二次分析，并結(jié)合P值和差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)的相關(guān)數(shù)值進行篩選，其中將P<0.01，F(xiàn)C>1.5作為明顯差異基因的篩選條件。

1.4已知的OP相關(guān)疾病靶點檢索利用“osteoporosis”作為關(guān)鍵詞，對五大常用數(shù)據(jù)庫(包括TTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、GAD、PharmGKB等)進行已知的疾病靶點的檢索及篩選。刪除檢索結(jié)果中重復的靶點，即可獲得OP發(fā)病過程已知的靶點。

1.5蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點篩選蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)繪制主要借助于BisoGenet插件，其中BisoGenet是由6種蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫構(gòu)成的，包括Biological General Repository for Interaction Datasets(BioGRID)、Biomolecular Interaction Network Database(BIND)、Molecular Interaction Database(MINT)、Human Protein Reference Database(HPRD)、Database of Interacting Proteins(DIP)和Biological General Repository for Interaction Datasets(GRID)等。本研究將淫羊藿上述的作用靶點和OP相關(guān)的疾病靶點分別映射到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中，利用BisoGenet插件對2個蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進行繪制，同時利用cytoscape合并2個蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并對交集網(wǎng)絡(luò)進行抽取，抽取獲得的交集網(wǎng)絡(luò)即為淫羊藿治療OP的直接和間接靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

Fig 1 Flow chart of molecular mechanism analysis of Epimedium in treatment of osteoporosis

結(jié)合相關(guān)文獻，并借助自由度、中心中介性、特征向量中心性、緊密度、網(wǎng)絡(luò)中心性和局部邊連通性等指標，采用網(wǎng)絡(luò)拓撲分析插件CytoNCA篩選出自由度大于所有節(jié)點自由度中位數(shù)2倍的節(jié)點，即“Big hubs”；然后，篩選網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點，再篩選其他幾個指標大于所有節(jié)點中位數(shù)的節(jié)點，即關(guān)鍵基因。上述獲得的相關(guān)活血成分及靶點則有可能是直接、間接調(diào)控這些節(jié)點，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。

1.6Pathway富集分析本研究采用了較為新穎的ClueGO分析插件，對上述OP的關(guān)鍵靶點及獲得的信號通路進行富集分析，并根據(jù)重要程度繪制信號通路占比餅狀圖；其中ClueGO插件在一定程度上可將富集分析的結(jié)果以節(jié)點的形式展現(xiàn)，以充分發(fā)揮形象的圖像化功能，同一類型的信號通路采用同一種顏色的節(jié)點代表，同時節(jié)點的大小代表了該信號通路的顯著性，信號通路的顯著性越高，節(jié)點越大，說明該通路的重要性越高。

2 結(jié)果

2.1淫羊藿活性成分篩選與ADME分析本研究通過對TCMSP數(shù)據(jù)庫淫羊藿單味中藥中所有的已報道的成分及其 ADME參數(shù)的相關(guān)檢索，共搜集到成分130個。同時，根據(jù)OB和DL參數(shù)對淫羊藿中入血的活性成分進行篩選，共搜集到入血活性成分23個，見Fig 2、Tab 1。利用相關(guān)靶點預(yù)測技術(shù)對上述活性成分進行作用靶點預(yù)測，排除重復靶點，共獲得預(yù)測靶點101個。

2.2淫羊藿“活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)”構(gòu)建和分析將上述活性成分及預(yù)測靶點采用網(wǎng)絡(luò)圖形化工具Cytoscape對潛在活性成分和作用靶點的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進行繪制和分析，以查找網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點，進而確定淫羊藿中發(fā)揮重要作用的成分和靶點。如Fig 3所示，通過Cytoscape網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建共獲得110個節(jié)點和230個關(guān)系。

Fig 2 ADME parameter distribution ofactive ingredients of blood entering blood in Epimedium

A: Components that meet the criteria for screening inEpimedium; B: Component ratio in accordance with the screening conditions inEpimedium.

Fig 3 Compound-target network of Epimedium

2.3OP相關(guān)基因分析和檢索

2.3.1OP相關(guān)差異表達基因分析 通過對GEO芯片數(shù)據(jù)庫的基因芯片進行二次挖掘分析，獲取骨密度高低不同的骨細胞的基因表達譜中明顯影響和改變的基因共124個，進一步分析淫羊藿的作用靶點是否與這些明顯改變的基因相關(guān)，同時探討這些基因與OP及其并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)關(guān)系。差異表達基因熱圖見Fig 4。

Tab 1 The active ingredients of blood entering blood in Epimedium according to ADME parameters

Fig 4 Different expression genes of osteoporosis

2.3.2數(shù)據(jù)庫檢索已有OP相關(guān)靶點 本研究檢索了5個國際公認的疾病基因相關(guān)數(shù)據(jù)庫，搜集前期研究和報道的與OP發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的已知的相關(guān)靶點基因，其中TTD、DrugBank、OMIM、GAD、PharmGKB 分別檢索到44、0、57、295、10個靶點，刪除重復靶點，共檢索到356個已知的OP發(fā)病過程中相關(guān)的靶點。

2.4淫羊藿治療OP的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點篩選

2.4.1淫羊藿治療OP的蛋白相互作用 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建機體的內(nèi)在調(diào)控往往不是單一的信號通路支配的，而是復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。不同的信號通路和靶點之間會存在一定程度的信號轉(zhuǎn)導，故藥物的治療作用除表現(xiàn)為成分靶點的直接結(jié)合外，更多見于直接調(diào)控靶點與間接調(diào)控其他靶點相結(jié)合的調(diào)控方式。而蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)為尋找靶點的直接、間接調(diào)控作用關(guān)系提供了可能。通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，本研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿可以與6 127個靶點產(chǎn)生直接或間接作用，而這些靶點與靶點之間的相互聯(lián)系多達148 246種。以此同時，對OP相關(guān)的靶點繪制蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，也發(fā)現(xiàn)與OP直接或者間接相關(guān)的靶點也多達6 129個。本研究利用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，進一步深入分析淫羊藿影響OP發(fā)生、發(fā)展中的靶點，繪制蛋白質(zhì)相互作用靶點網(wǎng)絡(luò)，為網(wǎng)絡(luò)分析和機制的探討提供了可能。

2.4.2淫羊藿治療OP的關(guān)鍵 本研究通過對淫羊藿調(diào)控OP的蛋白質(zhì)相互作用交集網(wǎng)絡(luò)和網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的拓撲屬性分析進行靶點篩選，旨在尋找網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點，并在網(wǎng)絡(luò)中獲得更多節(jié)點的傳遞信息和更高的節(jié)點信息傳遞效率，充分發(fā)揮其在網(wǎng)絡(luò)中重要的作用。通過網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，本研究共發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵節(jié)點221個。篩選策略示意圖見 Fig 5。

2.5淫羊藿治療OP的機制分析本研究對上述221個關(guān)鍵節(jié)點利用ClueGO進行分析，分析其參與的主要信號通路，研究淫羊藿治療OP可能的作用機制。分析結(jié)果顯示，淫羊藿除與直接作用于OP關(guān)鍵節(jié)點涉及的信號通路，如Wnt信號通路、TGF-β信號通路、Notch信號通路等有關(guān)，還對PI3K-Akt信號通路、VEGF信號通路、甲狀腺素信號通路等同時進行調(diào)控(Fig 6)。

3 討論

隨著全球人口數(shù)量增加，伴隨人口老齡化的加速發(fā)展，OP患者人數(shù)逐年遞增，長時間應(yīng)用抗骨質(zhì)疏松藥物尤其是雙膦酸鹽的不良反應(yīng)逐漸被重視[7]，抗骨質(zhì)疏松新藥的研發(fā)仍不斷探索[8]。許多中藥及復方在防治OP方面發(fā)揮著重要的作用。中醫(yī)學認為，腎乃先天之本，而骨的生長、發(fā)育及衰弱均與腎精盛衰關(guān)系緊密，OP屬腎虛，因此中醫(yī)治療以補腎為主。

淫羊藿又稱“三枝九葉草”，屬小蘗科淫羊藿屬，其味甘、辛，性溫，是補腎的壯陽藥，具有強筋骨、補腎陽、祛風濕功效。淫羊藿最早出自《神農(nóng)本草經(jīng)》，屬中品行列，具有補精壯體的記載，淫羊藿在抗骨質(zhì)疏松方面具有較好的臨床療效[9-11]。本研究根據(jù)OB和DL參數(shù)，共篩選出淫羊藿中入血的活性成分23個，對上述活性成分進行潛在活性成分和作用靶點的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)繪制，共獲得110個可能的靶點和230個相互關(guān)系。“活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)”分析顯示，木犀草素、槲皮素、谷甾醇、山奈酚等有效成分能作用于網(wǎng)絡(luò)中的多個靶點，而PPARG、ESR1、AR等靶點也能與多個成分作用?；谏鲜鼋Y(jié)果可知，淫羊藿的有效成分之間存在協(xié)同，而協(xié)同調(diào)控的靶點也在OP的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮不同作用，具有治療OP的潛力。

Fig 5 Target screening strategy for key nodes in Epimedium

Fig 6 Enrichment analysis of Epimedium in signaling pathway in treatment of osteoporosis

The enrichment analysis is represented by the pie charts (right) as generated by ClueGo and the most vital term in the group is labeled (left).

從富集結(jié)果分析可知，淫羊藿主要從直接影響骨代謝和間接調(diào)節(jié)骨代謝兩方面發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。① 直接影響骨代謝。骨吸收和骨形成過程中的動態(tài)平衡異常是導致OP發(fā)生、發(fā)展過程中重要的發(fā)病機制，而影響骨代謝的相關(guān)信號通路也是調(diào)控過程中主要的信號通路。上述結(jié)果顯示，主要富集在Wnt信號通路、TGF-β信號通路、MAPK信號通路、Notch信號通路和破骨細胞分化通路等。TGF-β能通過調(diào)節(jié)由間葉細胞衍生而來的前體細胞，促進其分別向軟骨細胞、成骨細胞分化，抑制破骨細胞的活性[12-13]。Notch在成骨細胞分化過程的早期階段表達時，通過誘導成骨細胞中骨保護素的表達，抑制成骨細胞向成熟成骨細胞表型和成骨細胞功能發(fā)展，從而抑制破骨細胞形成和骨吸收[14]。MAPK對細胞的增殖、分化進行調(diào)控，進而發(fā)揮相應(yīng)的生物學作用，在維持骨代謝平衡方面具有重要作用[15]。上述結(jié)果提示，淫羊藿抗OP的重要機制是調(diào)節(jié)OP發(fā)生、發(fā)展過程中骨代謝平衡異常的相關(guān)信號通路。② 間接影響骨代謝。在明顯富集的信號通路中仍存在部分調(diào)控其他系統(tǒng)的信號通路，如PI3K-Akt信號通路、甲狀腺素信號通路、心肌收縮信號通路、VEGF信號通路等。體內(nèi)代謝之間是相互作用、相互聯(lián)系的，通過全身其他系統(tǒng)，如循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多種代謝可以間接影響或干預(yù)骨微環(huán)境。

上述通路富集結(jié)果還顯示，網(wǎng)絡(luò)集群中還覆蓋了EB病毒感染、泛素介導的蛋白水解、酒精中毒、DNA復制、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白加工等信號通路。故說明淫羊藿除直接作用于骨代謝相關(guān)信號通路，還具有影響體內(nèi)多種代謝途徑的靶點以發(fā)揮抗OP作用的潛力。

通過上述通路網(wǎng)絡(luò)圖，本研究發(fā)現(xiàn)，上述通路在一定程度上與其他相關(guān)通路間存在多種多樣的相互作用關(guān)系，提示我們在治療OP時應(yīng)在針對局部關(guān)鍵通路的基礎(chǔ)上，仍應(yīng)針對疾病病因、所處機體環(huán)境，進行多靶點、多系統(tǒng)干預(yù)，這也恰恰體現(xiàn)中醫(yī)藥治療疾病的特點——治病求本、標本兼治，也進一步說明中醫(yī)多靶點、多方面進行綜合干預(yù)的可行性和優(yōu)勢。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學分析手段，篩選了淫羊藿的入血成分，并預(yù)測了其可能的直接作用靶點。進一步的蛋白質(zhì)相互功能網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析，確定了淫羊藿治療OP的直接和間接調(diào)控靶點，并以此為基礎(chǔ)分析及可能的作用機制。從筆者分析的結(jié)果來看，淫羊藿主要機制是促進成骨細胞增殖或抑制破骨細胞生成以及雙向調(diào)節(jié)的活性成分，發(fā)揮抗OP的作用。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學分析藥物與疾病靶點的相互網(wǎng)絡(luò)關(guān)系能有效地揭示淫羊藿治療OP的疾病機制，為后續(xù)機制進一步的探討和實驗設(shè)計的優(yōu)化等提供了重要的基礎(chǔ)，使實驗研究更加合理、更加具有指導性。同時，本文也為相關(guān)機制的研究提供了思路和方法，尤其是中藥及其復方針對某種特定疾病的機制分析。

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