楊青山，吳樹金，施松波，毛新展, 郭士方，陳志信，臺(tái)會(huì)平

(甘肅省人民醫(yī)院1. 骨科、2. 藥劑科，甘肅 蘭州 730000；3. 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院骨科，湖南 長(zhǎng)沙 410011)

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)病率明顯增加的慢性關(guān)節(jié)疾病, 病因及機(jī)制復(fù)雜，迄今仍未闡明。糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是體內(nèi)蛋白質(zhì)及脂類與葡萄糖或其他還原單糖發(fā)生非酶糖化反應(yīng)生成的穩(wěn)定共價(jià)化合物，它在關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)大量產(chǎn)生與積聚是導(dǎo)致OA病變的重要原因之一[1]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，AGEs 能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ，PPARγ)的表達(dá)下調(diào)，并在OA 病變中起重要作用[2]。PPARγ的重要作用之一為可以通過其輔助活化因子-1α(peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1 alpha，PGC-1α)，調(diào)控線粒體功能[3]，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。

姜黃素(curcumin)是從姜科姜黃屬植物姜黃中提取的一種黃色酸性酚類物質(zhì)，是姜黃發(fā)揮藥理作用的活性成分。姜黃素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等多種藥理作用[4-6]，同時(shí)近年研究發(fā)現(xiàn)其可以有效上調(diào)PPARγ，被認(rèn)為是PPARγ的天然配體[7]。姜黃素基于PPARγ的作用靶點(diǎn)是否對(duì)AGEs誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用尚不清楚。因此，本研究將直接使用外源性AGEs以排除其他因素的影響，在體外培養(yǎng)的家兔軟骨細(xì)胞上，探討AGEs誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡是否與PPARγ下調(diào)/線粒體功能損傷有關(guān)，同時(shí)觀察姜黃素是否基于上調(diào)PPARγ而發(fā)揮保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)健康家兔(5周齡)由蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循的所有程序均符合國(guó)家及甘肅省人民醫(yī)院制訂的有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的規(guī)則和制度。

1.1.2試劑 環(huán)孢霉素A (cyclosporine A，CsA)、PPARγ抗體購(gòu)自Calbiochem (La Jolla, CA, USA)；姜黃素(批號(hào)C1386)、PPARγ特異性抑制劑GW9662(批號(hào)70785)、吡格列酮 (批號(hào)P4120)，均購(gòu)自Sigma公司；PPARγ活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司；ATP檢測(cè)試劑盒、TUNEL、Rhodamine-123、caspase-3活性檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；其余試劑均為化學(xué)分析純。

1.1.3儀器 LS-50B型熒光分光光度計(jì)(日本Shimadu公司)；IX-70型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)SHEL-LAB公司)；Model 3.9 EL酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)。

1.2AGEs的體外制備配制0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)，然后將BSA(10 g·L-1)、D-羥乙醛(0.1 mol·L-1)、青鏈霉素(100 kU·L-1)分別溶于上述PBS中，充分搖勻，pH調(diào)至7.4，室溫下放置24 h；用0.22 μm針頭濾器過濾，滅菌、封口，置37℃恒溫箱避光孵育7 d后取出，再轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱無菌保存?zhèn)溆?。使用前，將制備的AGEs裝入透析袋，放入pH 7.4的無菌PBS透析液中，透析48 h，中途更換PBS液3～4次，除去未結(jié)合的D-羥乙醛，再次用0.22 μm針頭濾器過濾。取制備的樣品用熒光分光光度計(jì)鑒定，在激發(fā)波長(zhǎng)370 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm處釋放熒光。

1.3兔軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)將家兔麻醉后，在無菌條件下迅速取膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)處軟骨，用無菌PBS沖洗2～3遍后，將其剪成1～3 mm3碎塊，將所制軟骨碎塊轉(zhuǎn)移至25 mL無菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加10 mL 0.2%的胰蛋白酶后，置37℃ CO2培養(yǎng)箱孵育,每隔15 min振蕩1次，45 min后取出，將胰蛋白酶棄去，加入10 mL 0.2% Ⅱ型膠原酶，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱孵育，每隔15 min振蕩1次，90 min后收集消化液，重復(fù)用0.2% Ⅱ型膠原酶直至所取軟骨碎片全部消化，最后收集的消化液用200目紗網(wǎng)過濾去除雜質(zhì)，1 000 r·min-1離心10 min, 將下層的細(xì)胞層用配制好的DMEM培基稀釋后，按照2×105密度接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并加入15% 的FBS。3～5 d細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞80%融合后，開始鑒定并傳代，僅采用1～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)將細(xì)胞種植蓋玻片后，置于6孔板內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)過夜；刺激細(xì)胞發(fā)生凋亡后，吸盡培養(yǎng)液，在樣品中加100 μL TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育60 min后，PBS洗滌3次；用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)為450 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為550 nm。

1.5ATP生成檢測(cè)細(xì)胞處理后吸除培養(yǎng)液，按6孔板每孔加200 μL比例加入裂解液，裂解后4℃ 12 000×g離心10 min，收集上清，BCA測(cè)定蛋白濃度。把ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液用ATP檢測(cè)裂解液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻葌溆?；按?6孔板每孔100 μL的體積配制適當(dāng)量的ATP檢測(cè)液，每孔加入100 μL的ATP檢測(cè)液，室溫放置5 min，消耗掉本底ATP；每孔加入50 μL的標(biāo)準(zhǔn)品，輕輕搖晃均勻，立即在酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.6線粒體跨膜電位(△Ψm)檢測(cè)將處理后細(xì)胞PBS漂洗2次，150 μL PBS重懸細(xì)胞，20 μL Rhodamine 123避光染色，37℃避光孵育30 min，熒光分光光度計(jì)激發(fā)波長(zhǎng)507 nm，散發(fā)波長(zhǎng)529 nm檢測(cè)。

1.7caspase-3活性檢測(cè)吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，用胰酶消化貼壁細(xì)胞，并收集至備用的細(xì)胞培養(yǎng)液中，600×g4℃離心5 min收集細(xì)胞，小心吸除上清，PBS洗滌1次，吸盡上清后，按照每2×106個(gè)細(xì)胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min，4℃、20 000×g離心10～15 min后，放入試劑盒檢測(cè)體系中檢測(cè)。

1.8Real-timePCR采用TRIzol 法提取總RNA，取總RNA 5 μL，olig(dT)1 μL ，加DEPC水至12 μL，混勻，4 000 r·min-1離心5 s, 70℃孵育5 min后，于冰上冷卻5 min，再加入5×Buffer 4 μL，10 mmol·L-1dNTP 2 μL, 40 U/μL RNase Inhibitor 1 μL, 加DEPC水處理到19 μL混勻，4 000 r·min-1離心5 s，37℃反應(yīng)5 min，冰上驟冷5 min, 加入逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，總反應(yīng)體系20 μL混勻，4 000 r·min-1離心5 s，之后于42℃反應(yīng)60 min，72℃反應(yīng)10 min，冰上驟冷結(jié)束反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以繼續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取PCR產(chǎn)物5 μL，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后攝片，用Imagemaster VDS圖像分析軟件測(cè)定產(chǎn)物條帶的積分光密度值。PPARγ 上游引物：5′-AGGAGCAGAGCAAAGAGGTGGC-3′，下游引物：5′-TGTGAGGACTCAGGGTGGTTCA-3′。 GAPDH上游引物：5′-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′，下游引物：5′-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3′。

1.9PPARγ活性檢測(cè)采用基于ELISA 的DNA-binding 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PPARγ 活性。取10 μg核蛋白，加入事先包被有PPARγ特異性雙鏈DNA結(jié)合位點(diǎn)的96孔板上，4℃孵育過夜。結(jié)合的PPARγ經(jīng)特異的PPARγ標(biāo)記顯色后檢測(cè)。

1.10Westernblot提取總蛋白，并用牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線調(diào)整為一致濃度后，溶解在10 g·L-1十二烷基硫酸鈉(SDS)中，每份樣品取8 μL進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h。倒掉封閉液,用5%的脫脂奶粉按比例稀釋一抗，將膜置于一抗孵育液中，4℃搖動(dòng)(20～30次/min)過夜，用TBST洗膜3次，每次5 min。用5%的脫脂奶粉按一定比例稀釋二抗，將膜置于二抗孵育液中，室溫孵育1 h(20～30次/min)，用TBST洗膜4次，每次5 min。用ODYSSEY Fc imaging system顯色，拍照。數(shù)據(jù)用樣品與β-actin的比值表示。

Cur: Curcumin; Pio: Pioglitazone; CsA: Cyclosporine A.*P<0.05vscontrol;ΔP<0.05vsAGEs;#P<0.05vsAGEs+Curcumin;▲P<0.05vsAGEs+ Pioglitazone

2 結(jié)果

2.1AGEs對(duì)家兔軟骨細(xì)胞凋亡的影響及姜黃素的作用如Fig 1所示，AGEs (200 mg·L-1)孵育48 h后，可以明顯誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞的凋亡；線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的抑制劑CsA(100 nmol·L-1)同樣可以明顯抑制AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P<0.05)。同時(shí)，PPARγ特異性激動(dòng)劑吡格列酮(50 μmol·L-1)及50 μmol·L-1姜黃素均可以明顯抑制AGEs誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡；50 μmol·L-1姜黃素單獨(dú)處理組對(duì)軟骨細(xì)胞未見明顯代謝及功能影響[11]，而給予PPARγ 特異性拮抗劑GW9662 10 μmol·L-1預(yù)處理后，可以明顯拮抗姜黃素及吡格列酮對(duì)AGEs誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

2.2AGEs對(duì)家兔軟骨細(xì)胞線粒體功能的影響及姜黃素的作用如Fig 2所示，AGEs(200 mg·L-1)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞線粒體△Ψm及ATP合成明顯降低，姜黃素50 μmol·L-1及吡格列酮 50 μmol·L-1均可明顯抑制AGEs的損傷作用。GW9662 10 μmol·L-1預(yù)處理后，可以明顯拮抗姜黃素及吡格列酮對(duì)AGEs誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞線粒體△Ψm及ATP合成下降的保護(hù)作用。

Fig 2 Effect of curcumin on AGEs-induced mitochondrialfunction of chondrocytes (±s, n=8)

A: Effect of curcumin on AGEs-induced mitochondrial membrane potential ( △Ψm); B: Effect of curcumin on AGEs-induced mitochondrial ATP production.*P<0.05vscontrol;△P<0.05vsAGEs;#P<0.05vsAGEs+Curcumin;▲P<0.05vsAGEs+Pioglitazone

Fig 3 Effect of curcumin on AGEs-induced expression ofcytochrome C (A), Bax and Bcl-2 (B), caspase-3(C) (±s, n=8)

*P<0.05vscontrol;ΔP<0.05vsAGEs;#P<0.05vsAGEs+Curcumin;▲P<0.05vsAGEs+ Pioglitazone

Fig 4 Effect of curcumin on AGEs-induced activity and

A: PPARγ activity；B: PPARγ protein level; C: PPARγ mRNA assayed by real-time PCR.*P<0.05vscontrol;ΔP<0.05vsAGEs;#P<0.05vsAGEs+Curcumin.

2.3AGEs對(duì)家兔軟骨細(xì)胞細(xì)胞色素C、caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)的影響如Fig 3所示，與正常對(duì)照相比，AGEs (200 mg·L-1)能夠明顯誘導(dǎo)細(xì)胞色素C、caspase-3、Bax/Bcl-2比值增加，而姜黃素50 μmol·L-1及吡格列酮 50 μmol·L-1均可明顯抑制AGEs的上述作用；GW9662 10 μmol·L-1預(yù)處理后，可以明顯拮抗姜黃素及吡格列酮對(duì)AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞色素C表達(dá)、caspase-3活性、Bax/Bcl-2增加的抑制作用。

2.4AGEs對(duì)家兔軟骨細(xì)胞PPARγ表達(dá)的影響及姜黃素的作用如Fig 4所示，AGEs (200 mg·L-1)可以明顯誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞PPARγ活性降低，同時(shí)伴隨PPARγ的mRNA及蛋白表達(dá)降低；50 μmol·L-1的姜黃素可以明顯上調(diào)PPARγ活性、mRNA及蛋白表達(dá)，同時(shí)，GW9662 10 μmol·L-1預(yù)處理1 h后，可以明顯抑制姜黃素的作用。

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以明顯抑制AGEs誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡及線粒體功能損傷，并明顯上調(diào)AGEs誘導(dǎo)的PPARγ活性的降低，伴隨PPARγ相應(yīng)的mRNA及蛋白水平的升高，給予PPARγ 特異性拮抗劑GW9662預(yù)處理后，可以明顯拮抗姜黃素的保護(hù)作用。該結(jié)果表明，基于上調(diào)PPARγ的作用靶點(diǎn)，姜黃素可明顯抑制AGEs誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞線粒體損傷，進(jìn)而抑制AGEs誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。

在本研究中，為了探討線粒體損傷在AGEs致OA病變中的作用，我們直接使用外源性AGEs以排除體內(nèi)其他因素的影響，發(fā)現(xiàn)AGEs可以使得軟骨細(xì)胞線粒體ATP生成減少，跨膜電位(△Ψm )降低，同時(shí)caspase-3活性增加，細(xì)胞色素C釋放增加，Bax/Bcl-2的比值增加。這些結(jié)果提示AGEs可以誘導(dǎo)線粒體功能損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放, Bax/Bcl-2的比值增加，激活caspase細(xì)胞凋亡途徑, 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡, 促進(jìn)OA的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，PPARγ特異性激動(dòng)劑吡格列酮可以明顯抑制AGEs誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞線粒體功能損傷，而預(yù)先給予PPARγ 特異性拮抗劑GW9662可以明顯拮抗吡格列酮的作用。該結(jié)果提示，PPARγ的下調(diào)可能為AGEs誘導(dǎo)的線粒體功能損傷的重要機(jī)制之一。關(guān)于PPARγ對(duì)線粒體功能的調(diào)節(jié)作用的機(jī)制可能主要與PPARγ上調(diào)PGC-1α有關(guān)。PGC-1α與其下游的目標(biāo)基因核呼吸因子-1(nuclear respiratory factor 1，NRF-1)結(jié)合后可以調(diào)控線粒體轉(zhuǎn)錄，呼吸基因的調(diào)節(jié)，另外，還可以通過誘導(dǎo)線粒體脂肪酸和亞鐵血紅素生物合成途徑，提高線粒體的氧化功能[3, 8]。關(guān)于AGEs下調(diào)PPARγ 后，是否通過PGC-1α途徑誘導(dǎo)線粒體功能損傷，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證基于PPARγ靶點(diǎn)的保護(hù)藥物是否對(duì)AGEs誘導(dǎo)的線粒體功能損傷具有保護(hù)作用，我們觀察了姜黃素對(duì)AGEs誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的作用。姜黃素已在多種細(xì)胞上被證實(shí)可以明顯上調(diào)PPARγ。文獻(xiàn)報(bào)道，在阿爾茨海默病大鼠模型中，姜黃素通過上調(diào)PPARγ明顯抑制β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥[9]；Li等[10]研究表明，姜黃素通過提高PPARγ活性，抑制氧化應(yīng)激，從而抑制血管緊張素II誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞炎癥和增殖。關(guān)于姜黃素對(duì)PPARγ的上調(diào)作用機(jī)制尚不十分清楚，姜黃素或?yàn)镻PARγ的天然配體，與PPARγ直接結(jié)合后激活PPARγ，或通過與體內(nèi)某些受體結(jié)合后間接激活PPARγ，尚需要進(jìn)一步的研究證實(shí)[11-12]。關(guān)于姜黃素對(duì)OA病變的保護(hù)作用已在OA患者或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)，其可以有效緩解OA病變炎癥反應(yīng)及疼痛等相關(guān)臨床癥狀[13-15]，而姜黃素是否通過基于PPARγ靶點(diǎn)發(fā)揮保護(hù)OA病變作用，尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，姜黃素可以明顯抑制AGEs誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡及線粒體功能的損傷；而預(yù)先給予PPARγ 特異性拮抗劑GW9662處理后，可以有效拮抗姜黃素對(duì)AGEs誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡及線粒體功能損傷的保護(hù)作用；同時(shí)，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)姜黃素可以明顯上調(diào)AGEs誘導(dǎo)的PPARγ活性的降低，伴隨PPARγ相應(yīng)的mRNA及蛋白表達(dá)水平的升高。該研究結(jié)果提示，姜黃素上調(diào)PPARγ的活性及表達(dá)可能為姜黃素保護(hù)AGEs誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞線粒體功能損傷的重要機(jī)制之一。

綜上，本研究表明，AGEs通過下調(diào)PPARγ誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞線粒體功能損傷，從而激活caspase凋亡途徑，最終導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡，其中線粒體功能受損可能起了關(guān)鍵作用；同時(shí)，姜黃素基于PPARγ的作用靶點(diǎn)，有效保護(hù)AGEs誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞線粒體損傷，抑制軟骨細(xì)胞凋亡。另外，由于AGEs形式各異、分子量大、生成易分解難、體內(nèi)不易清除等特點(diǎn)，使得PPARγ-線粒體損傷這一通路持續(xù)活化, 并且線粒體損傷后誘發(fā)大量ROS產(chǎn)生，又可反過來誘導(dǎo)AGEs特異性作用受體RAGE的表達(dá)，從而起到正反饋的作用，這或許可以解釋為什么OA患者的病變呈持續(xù)、進(jìn)行性地發(fā)展。姜黃素來源方便、經(jīng)濟(jì)，長(zhǎng)期服用安全性高，多項(xiàng)臨床研究已證實(shí)其可有效減輕OA患者的病理生理進(jìn)展及緩解疼痛，本研究結(jié)果將為姜黃素保護(hù)AGEs所致OA病變的發(fā)生發(fā)展提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝：本研究主要在甘肅省人民醫(yī)院科研中心完成，感謝課題組成員在本研究過程中提供幫助與指導(dǎo)。)

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