張嘉明，易增興，林世清，王益敏,5，蔡 哲，魏 明，孫來保，鄒學農(nóng)

(1.惠州市中大惠亞醫(yī)院麻醉科，廣東 惠州 516081；2.宜春學院化學與生物工程學院藥學教研室，江西 宜春 336000；3.中山大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510080；4.中山大學附屬第一醫(yī)院脊柱外科，廣東 廣州 510080；5.廣東省骨科學重點實驗室，廣東 廣州 510080)

慢性腰腿痛是導致勞動力喪失的主要疾病，給社會造成了沉重的經(jīng)濟負擔。椎間盤突出髓核的生化致炎特性作用是引起周圍神經(jīng)根炎癥，并引起慢性腰腿痛的主要原因，因此也成為當前腰椎間盤突出癥發(fā)病機制的研究熱點。p38促分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)、白介素-18(interleukin-18, IL-18)及其受體(interleukin-18 receptor, IL-18R)的激活是導致神經(jīng)病理性疼痛和炎癥性疼痛的關(guān)鍵因素，并且它們之間存在著密切聯(lián)系[1]。在腰椎間盤突出癥導致腰腿痛的發(fā)病機制中，它們是否具有類似的效應，目前尚未闡明。臨床實踐表明，抑制炎癥反應是治療腰腿痛的重要措施。

中藥單體蛇床子素(osthole, Ost)又名歐芹酚甲醚或甲基歐芹酚，能有效減輕由椎間盤突出誘發(fā)的急、慢性腰腿痛，但具體機制尚不清楚。本課題組前期研究提示，Ost能通過抑制髓核致炎神經(jīng)根痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)NOS、COX-2、降鈣素基因相關(guān)肽受體1、3型酸敏感離子通道等的表達，抑制炎性痛的外周敏化，提高大鼠50%機械性撤足閾值(mechanical withdrawl threshold，MWT)，從而達到緩解神經(jīng)根痛覺過敏的作用[2-6]，但是它能否抑制炎癥在脊髓背角內(nèi)的中樞敏化效應，值得我們進一步探討。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級♂成年SD大鼠156只，體質(zhì)量(235±15)g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2013-0002。分籠飼養(yǎng), 室溫(20±2)°C , 維持大鼠12 h/12 h晝夜交替(每天8 ∶00～20 ∶00光照)。本實驗嚴格遵守中山大學動物保護和使用的規(guī)定。

1.2試劑與儀器蛇床子素(廣州展晨生物科技有限公司)，用100 mL·L-1二甲亞砜(DMSO，Sigma，USA)溶解；兔抗鼠IL-18一抗(DF6252，Affinity，USA)；兔抗鼠IL-18R一抗(A1414，Santa Cruz, USA)；兔抗鼠p-p38 MARK一抗(Thr180，Affinity，USA)。Frey 纖毛儀(Stoelting 公司，USA)；冰凍組織包埋機(美國Thermo公司)；倒置熒光顯微鏡(美國Sakura公司)；顯微照相系統(tǒng)(日本NIKON公司)。

1.3動物模型建立、分組及處理

1.3.1動物模型建立 參照文獻建立動物模型[6]，質(zhì)量濃度為35 g·L-1的水合氯醛麻醉大鼠(3.5 mL·kg-1，腹腔注射), 固定大鼠，手術(shù)區(qū)備皮后消毒鋪巾，以兩側(cè)髂嵴最高點連線中點做30 mm左右正中切口，暴露皮膚組織和肌肉，關(guān)節(jié)定位后，分別咬除左側(cè)L5下關(guān)節(jié)突、L6上關(guān)節(jié)突和L5半椎板，暴露左側(cè)L5背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)。從L5半椎板切除處將 PE-10導管向頭側(cè)硬膜外腔輕柔置入約4 mm，并將其固定于同側(cè)肌肉組織，另一端經(jīng)皮下隧道從兩耳之間引出，回抽無血和腦脊液流出，電凝灼燒封管固定，充分止血后，無菌生理鹽水沖洗傷口。消毒鼠尾，20 G針頭沿錐體間隙刺取近端2個節(jié)段自體髓核組織(約0.4 mg)，置于L5DRG周圍。止血充分后逐層縫合傷口，聚維酮碘軟膏擦拭縫合皮膚。Sham組取尾部自體髓核組織，但不將其置于L5DRG部位，其余操作同上。

1.3.2分組及處理 SPF級成年♂SD大鼠156只，分為Blank組(n=36)、假手術(shù)組(Sham組，n=36)、模型組(NP組，n=36)、溶劑對照組(DMSO組，n=24)和蛇床子素組(Ost組，n=24)。術(shù)后d 2，DMSO組給予100 mL·L-1DMSO，Ost組給予20 g·L-1蛇床子素，1 min內(nèi)注射完，注射完畢后用100 mL·L-1DMSO溶液10 μL沖盡導管內(nèi)殘留藥液。將手術(shù)日記為d 0，各組大鼠分別于術(shù)前1 d(d-1)，術(shù)后1天(d 1)、2天(d 2)、6天(d 6)、7天(d 7)、12天(d 12)、14天(d 14)、21天(d 21)和28天(d 28)測定50% MWT。給藥后5天(d 7)和第12天(d 14)取術(shù)側(cè)脊髓背角，用Western blot法檢測p38 MAPK、IL-18和IL-18R的蛋白相對濃度。qPCR法測定IL-18 mRNA表達量。

1.4測定50%MWT建模前，每日9 ∶00～16 ∶00將大鼠放于透明有機玻璃箱內(nèi)自由活動，以適應測試環(huán)境，并于術(shù)前1 d測定大鼠的基礎(chǔ)縮足閾值。術(shù)后行為學測試也在該時間段內(nèi)進行，測試前，大鼠預先在玻璃箱中適應30 min，待其安靜后再進行測試。檢測50% MWT：大鼠置于玻璃箱內(nèi)，安靜后以不同強度的von Frey纖毛刺激大鼠足心部皮膚，避開肉墊使之稍成S形，持續(xù)6 ～ 8 s。若大鼠后肢出現(xiàn)迅速抬起、畏縮、撤回或舔舐足底，則認為是陽性反應。以2 g為初始刺激強度, 當該強度刺激不能引起陽性反應，則給予相鄰大一級強度刺激；若有陽性反應則給予相鄰小一級強度的刺激，每個強度重復刺激5次，如此連續(xù)進行，將出現(xiàn)3次以上陽性反應的最小von Frey纖維強度定為大鼠的50% MWT。相鄰2次刺激至少間隔約15 s，每次刺激前大鼠均處于安靜狀態(tài)。

1.5Westernblot法檢測p38、IL-18和IL-18R的蛋白相對濃度深麻醉下取出大鼠術(shù)側(cè)腰段L4～6脊髓背角，用預冷的PBS緩沖液漂洗2 ～ 3次，去除污血，剪成小塊置于勻漿器中。加入10倍于組織體積的組織蛋白提取試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)，冰浴徹底勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，振蕩。冰浴30 min，期間用移液器反復吹打，確保勻漿液完全裂解，4°C、12 000 r·min-1離心5 min，收集上清。SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)膜，接著用5%脫脂牛奶封閉1 h，除去封閉液，加入兔抗鼠p-p38 MAPK一抗(1∶1 000)、兔抗鼠IL-18一抗(1∶1 000)、兔抗鼠IL-18R(1∶200)，4°C孵育過夜。用TBS洗膜3次，每次5 min。再加入稀釋好的二抗(1∶2 500)，室溫下孵育30 min。將膜蛋白面?zhèn)扰c新鮮配制的ECL試劑反應后，依次壓片、顯影、定影。用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標條帶的光密度值。將每次實驗中各樣品灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值相除，得到每個樣品的蛋白相對含量。

1.6qPCR法測定IL-18mRNA表達量取大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角組織，按TRIzol 抽提法提取總RNA，紫外吸收測定法檢測RNA 濃度和純度。取適量RNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，-20℃保存待用。采用Primer 5.0 設(shè)計基因特異性引物，IL-18引物序列：5′-TGGGATTCGTTGGCTGTT-3′(上游)，5′-AGACCACTTTGGCAGACTTCA-3′(下游)；內(nèi)參β-actin引物序列：5′-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3′(上游)，5′-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3′(下游)，上述引物均由上海生物工程公司合成。RT-PCR 50 μL反應體系：SYBR Green染料10 μL，上游引物1 μL，下游引物 1 μL，dNTP 1 μL，Taq聚合酶2 μL，待測樣品cDNA 5 μL，ddH2O 30μL。將配制好的PCR反應溶液置于Real time PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93°C 2 min預變性，然后93°C 變性1 min，退火55 °C 1 min，延伸72°C 1 min，共40個循環(huán)，最后72°C 7 min延伸。運用Bio-Rad CFX 96熒光定量PCR儀配套的Bio-Rad CFX Manager Software1.6數(shù)據(jù)分析軟件進行分析，以IL-18 mRNA/β-actin mRNA的2-ΔΔCt值的比值作為IL-18 mRNA的表達水平。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠給予Ost前后50%MWT的測試結(jié)果各組大鼠術(shù)前的50% MWT比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)。與Blank組比較，Sham組大鼠的50% MWT在術(shù)后d 1有所下降(P<0.05)，隨后逐漸恢復至術(shù)前水平；NP組、Ost組和DMSO組大鼠在術(shù)后的d 1即出現(xiàn)50% MWT下降(P<0.05)，其中NP組和DMSO組大鼠持續(xù)降低至術(shù)后28 d，3組大鼠在給Ost前50% MWT無明顯差異(P>0.05)。給予相應藥物后各個時間點，與DMSO組比較，Ost組50% MWT升高(P<0.05)；DMSO組50% MWT在給藥前后無明顯變化(P>0.05)，與NP組各個時間點相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見Fig 1。

Fig 1 Comparison of 50% MWT before andafter epidural injection of drug

*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsDMSO group;△P<0.05vssame group (before application of drug)

2.2給予Ost后d5各組大鼠脊髓背角p-p38蛋白表達的變化給藥后5 d，與Blank組比較，Sham組、NP組、DMSO組和Ost組p-p38蛋白表達升高(P<0.05)。與DMSO組相比，Ost組p-p38蛋白表達降低(P<0.05)，NP組與DMSO組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見Fig 2。

Fig 2 Expression of p-p38 in different groupsafter epidural application of drug

A:The expression levels of p-p38 protein in the spinal dorsal horn of rats were analyzed by Western blot; B: Relative expression of p-p38 protein in the spinal dorsal horn of rats.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsDMSO group

2.3給予Ost后5d各組大鼠脊髓背角IL-18蛋白表達的變化給予Ost后5 d，與Blank組比較，Sham組、NP組、DMSO組、Ost組給藥后d 5 IL-18蛋白表達升高(P<0.05)。與DMSO組相比較，Ost組IL-18蛋白表達降低(P<0.05)，NP組與DMSO組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見Fig 3。

2.4給予Ost后12d各組大鼠脊髓背角IL-18R蛋白表達的變化給予Ost后12 d，與Blank組相比，Sham組、NP組、DMSO組、Ost組術(shù)后d 14 IL-18蛋白表達升高(P<0.05)。與DMSO組相比較，Ost組IL-18R蛋白表達降低(P<0.05)，NP組與DMSO組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見Fig 4。

2.5給予Ost后5d各組大鼠脊髓背角IL-18mRNA表達的變化給予Ost后5 d，與Blank組和Sham組相比，NP組、DMSO組、Ost組術(shù)后d 7 IL-18 mRNA表達量升高(P<0.05)。與DMSO組相比較，Ost組IL-18 mRNA表達量降低(P<0.05)，NP組與DMSO組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見Fig 5。

Fig 3 Expression of IL-18 in different groupsafter epidural application of drug

A:The expression levels of IL-18 protein in the spinal dorsal horn of rats were analyzed by Western blot; B: Relative expression of IL-18 protein in the spinal dorsal horn of rats.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsDMSO group

2.6各組大鼠脊髓背角p-p38MAPK與IL-18mRNA的相關(guān)性分析術(shù)后d 7將各組大鼠脊髓背角表達的p-p38 MAPK蛋白相對濃度與IL-18 mRNA含量進行Spearman 秩相關(guān)分析，p-p38 MAPK與IL-18 mRNA秩相關(guān)系數(shù)R=0.9，提示各組大鼠兩者之間的表達呈正相關(guān)(P<0.05)。

3 討論

MAPKs的激活在哺乳動物細胞信號轉(zhuǎn)導中起關(guān)鍵作用，可引發(fā)疼痛的外周敏化和中樞敏化，一定程度上加劇了傷害后所導致的痛覺過敏[7]，而p38 MAPK信號通路是MAPKs家族中重要的一條分支，一般由細胞應激和促炎因子激活。靜脈或鞘內(nèi)注射p38抑制劑已被證明能有效緩解炎癥和關(guān)節(jié)炎[8]。有研究認為，p38MAPK調(diào)控的下游靶基因主要有ICAM-1、IL-1、TNF-α、COX-2等，該通路與腰椎間盤退變和根性癥狀密切相關(guān)[9]。本實驗采用我們團隊前期成功改良的非壓迫性髓核致炎大鼠疼痛的標準化模型[6]，檢測顯示，在建立模型后d 7，NP組大鼠p-p38表達含量上調(diào)，這與Seki等[10]研究結(jié)果一致，提示了p38的磷酸化激活很可能參與了髓核致炎的致痛過程。而作為IL-1家族成員之一的IL-18，在神經(jīng)病理性疼痛和腰椎間盤突出誘發(fā)坐骨神經(jīng)痛的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。IL-18致炎效應可能與以下機制有關(guān)[11]：① 促進淋巴T細胞增殖；② 誘發(fā)粒-巨噬細胞集落刺激物、IL-8、單核細胞趨化物質(zhì)-1及巨噬細胞炎癥物質(zhì)-1等；③ 通過MAPK途徑發(fā)揮致炎作用。在本實驗建立模型后的d 7，NP組大鼠IL-18蛋白及mRNA表達上調(diào)，導致大鼠機械性痛閾值下降。表明脊髓背角中的IL-18很有可能參與了髓核致炎神經(jīng)根疼痛的過程。

Fig 4 Expression of IL-18R in different groupsafter epidural application of drug

A:The expression levels of IL-18R protein in the spinal dorsal horn of rats were analyzed by Western blot; B: Relative expression of IL-18R protein in the spinal dorsal horn of rats.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsDMSO group

Fig 5 Relative expression of IL-18 mRNA in different groupsafter epidural application of drug

*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsDMSO group

在衣原體誘發(fā)機體炎癥反應的研究中發(fā)現(xiàn)，有激活的IL-18與IL-1β表達，而給予p38 MAPK抑制劑后能夠明顯抑制它們的表達，證明了IL-18 與IL-1β是通過激活p38 MAPK通路而發(fā)揮致炎作用[12]。在一項神經(jīng)病理性疼痛模型研究中[13]，結(jié)扎L5背根神經(jīng)后可誘發(fā)大鼠機械性痛覺過敏，術(shù)后d 1開始出現(xiàn)大鼠脊髓背角內(nèi)IL-18蛋白表達上調(diào)，術(shù)后d 7 IL-18R蛋白表達升高，其表達的時間與我們結(jié)果不同，可能是神經(jīng)結(jié)扎后的炎癥反應在更早期即可形成。另外，該模型中，脊髓背角中的p38 MAPK激活誘發(fā)了IL-18蛋白表達上調(diào)。在給予p38 MAPK通路特異性抑制劑SB203580后，IL-18蛋白明顯下降，同時伴有IL-18R蛋白下降，說明IL-18發(fā)揮作用可能與p38 MAPK通路表達密切相關(guān)。本實驗在建立了穩(wěn)定的髓核致炎疼痛模型后，p-p38和IL-18 mRNA表達明顯上調(diào)，對p-p38MAPK與IL-18 mRNA表達進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者呈正相關(guān)關(guān)系。因此，IL-18 mRNA與p38 MAPK可能存在上下游信號通路關(guān)系。我們推測，在髓核致炎神經(jīng)根痛大鼠的炎癥發(fā)生早期，p38 MAPK通路激活后，可通過調(diào)控IL-18 mRNA基因表達，產(chǎn)生IL-18炎癥介質(zhì)形成炎癥反應，到中晚期出現(xiàn)IL-18R蛋白表達。p38 MAPK信號通路及相關(guān)炎癥因子IL-18和IL-18R的激活，共同介導了髓核致炎大鼠神經(jīng)根較長時間的炎性疼痛。

在治療腰椎間盤突出癥的中藥中，獨活寄生湯具有安全有效的療效，口服配合中藥離子導入治療腰椎間盤突出癥可以有效緩解患者臨床癥狀和體征，明顯降低患者體內(nèi)IL-6、IL-8及TNF-α的表達，從而緩解疼痛[14]。該方劑的主要成分是蛇床子，其主要的藥用活性成分是蛇床子素?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，其抗炎效果及機制相對廣泛[15]：① 通過抑制肥大細胞Ca2+通道，減少Ca2+內(nèi)流，從而減少組織胺釋放，穩(wěn)定其細胞膜而發(fā)揮止癢作用；② 可直接抑制CNS發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用，其本身化學結(jié)構(gòu)具有一定的局麻作用；③ 增強中樞神經(jīng)的突觸傳遞，促進學習和記憶；④ 抗衰老、抗氧化作用。在機械性腦損傷炎癥動物模型中，蛇床子素還可以抑制細胞凋亡，減輕炎癥反應，從而修復腦損傷等神經(jīng)系統(tǒng)難治性疾病[16]。除了上述藥理學效應，Ost的鎮(zhèn)痛作用也非常突出，可明顯抑制急性和慢性炎癥反應。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Ost具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛效應，它能抑制髓核致炎大鼠背神經(jīng)節(jié)內(nèi)COX-2、CGRPR1、ASIC3的表達，還能通過抑制脊髓背角內(nèi)ERK通路，降低下游COX-2 mRNA的表達，從而減輕神經(jīng)元的興奮性，抑制疼痛的外周敏化和中樞敏化，減弱大鼠的機械性和熱覺敏感性刺激[2-6, 17 ]。本實驗中，我們在術(shù)后d 2經(jīng)硬膜外導管給予Ost 1mg/rat，可改善大鼠自身髓核誘發(fā)的機械性痛敏；在術(shù)后d 7，Ost組大鼠脊髓背角p-p38和IL-18蛋白及IL-18 mRNA均發(fā)生下調(diào)；在術(shù)后d 14，IL-18R蛋白的表達出現(xiàn)下調(diào)。我們認為是由于蛇床子素在炎癥發(fā)生的早期通過下調(diào)p-p38和IL-18等炎癥介質(zhì)的表達，從而抑制疼痛的外周敏化，而在炎癥發(fā)生中晚期下調(diào)IL-18R蛋白的表達，進一步阻斷了炎癥向中樞傳遞，抑制了炎癥的中樞敏化效應。正是由于Ost可在炎癥發(fā)生的不同時期抑制炎癥介質(zhì)表達，使得術(shù)后大鼠的機械性痛敏能得到持續(xù)性緩解。

綜上所述，脊髓背角p38 MAPK信號相關(guān)通路參與了髓核致炎大鼠神經(jīng)根痛，在疼痛形成早期IL-18為主要炎癥參與介質(zhì)，在中晚期IL-18R為炎癥主要參與受體。術(shù)后單次硬膜外腔注射Ost可能通過抑制脊髓背角p-p38、IL-18、IL-18R蛋白和IL-18 mRNA的過度表達，從而有效緩解髓核致炎大鼠神經(jīng)根痛覺過敏。

(致謝：本實驗研究在廣州市中山大學第一附屬醫(yī)院骨科研究所完成，感謝各位老師和實驗室同事對本實驗的指導和幫助！)

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