管福琴，單 宇，黃真真，王奇志，陳 雨，印 敏，劉 飛，徐 曙，王 鳴，趙友誼，馮 煦

(江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，江蘇省植物資源研究與利用重點實驗室，天然產(chǎn)物研究中心，江蘇 南京 210014)

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性降解途徑，是細(xì)胞進行自我保護的一種重要機制，在維持細(xì)胞存活、更新、物質(zhì)再利用和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著重要作用[1]。近年來的研究顯示，自噬在腫瘤的治療中有不可忽視的作用：一方面，自噬可以清除腫瘤細(xì)胞內(nèi)折疊異常的蛋白和功能異常的細(xì)胞器, 防止基因組損傷，從而抑制腫瘤的發(fā)生；另一方面，腫瘤細(xì)胞可利用自噬作用使自身在營養(yǎng)缺乏和低氧的狀況下得以存活[2]。海蓬子皂苷甲(Bigelovii A，BA)是本課題組從鹽生植物海蓬子中分離得到的30-降齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，BA能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞HL-60凋亡[4]，同時可通過抑制NF-κB和p38 MAPK/ERK1/2，緩解LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷[5]。故本研究在此基礎(chǔ)上，以人乳腺癌細(xì)胞MCF7為研究對象，進一步觀察BA作用后，細(xì)胞自噬的發(fā)生及其在腫瘤細(xì)胞生長中的作用，并初步探索發(fā)生自噬的作用機制，擬為腫瘤防治提供新的思路。

1 材料

1.1細(xì)胞MCF7細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

1.2試劑BA由本實驗室從北美海蓬子干燥全草分離得到，純度>98%；MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、蛋白酶抑制劑，均購自Thermo Fisher Scientific公司；胰蛋白酶、青鏈霉素、二甲基亞砜(dimethylsul phoxide, DMSO)、四 甲 基 偶 氮 唑 鹽 (MTT)、吖啶橙(acridine orange, AO)、RIPA裂解液、預(yù)染蛋白Marker等均購自厚百生物商城；丹酰戊二胺(monodansyl cadaverine, MDC)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)購自Sigma公司； 所有免疫印跡抗體、ECL發(fā)光液均購自美國Cell Signaling公司。

1.3儀器Thermo 6500 CO2培養(yǎng)箱、NapFLOW 1200生物安全柜(美國Thermo公司)；Centrifuge 5804R高速離心機(德國Eppendorf公司)；IX51型熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Infinite M200全波長熒光酶標(biāo)儀(美國Tecan公司)；Accuri C6流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；MS3 digital 定時微量振蕩器(德國IKA公司)；LiBROR AEL-200電子天平(日本Shimadzu公司)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株MCF7培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。待細(xì)胞生長至80%融合后，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，1 mL PBS清洗后，加入1 mL胰蛋白酶于細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化，待貼壁細(xì)胞變圓后，吸掉胰酶，加入完全培養(yǎng)基吹打收集細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，倒掉上清，重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中，取一定量細(xì)胞接種培養(yǎng)板。

2.2AO染色檢測細(xì)胞自噬將75%乙醇浸泡過夜、紫外消毒殺菌的蓋玻片置于6孔板內(nèi)，種入細(xì)胞(2×108·L-1)培養(yǎng)過夜。用不同濃度的BA(10、20、40 μmol·L-1)處理24 h。吸盡培養(yǎng)液，用PBS在搖床上洗2遍，每次3 min，吸盡液體。加入1 mL AO染色液(1 mg·L-1)，搖床避光染色15 min。去染色液，加入1 mL PBS，洗2次，每次3 min，吸盡PBS。在載玻片上滴加抗熒光淬滅封片液，輕輕蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，盡量避免產(chǎn)生氣泡。在倒置熒光顯微鏡上觀察，藍(lán)光激發(fā)。

2.3MDC流式檢測細(xì)胞自噬取對數(shù)生長期MCF7細(xì)胞(2×108·L-1)接種，每皿2 mL。次日用不同濃度的BA(10、20、40 μmol·L-1)處理24 h；收集細(xì)胞上清中漂浮細(xì)胞，500×g離心5 min；同時，PBS洗細(xì)胞，胰酶消化2 min；收集細(xì)胞，500×g離心5 min。加入1 mL PBS 吹散細(xì)胞，加入到相應(yīng)漂浮細(xì)胞的管子中，500×g離心5 min；收集細(xì)胞，冷PBS洗1～2遍，盡量去干凈上清。加入1 mL PBS重懸細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中加入1 μL 0.05 mol·L-1MDC染色液，37 ℃避光染色1 h。500×g離心5 min，收集細(xì)胞；去上清，冷PBS洗1遍；流式細(xì)胞儀FL1通道檢測，分析處理實驗結(jié)果。

2.4Westernblot法檢測自噬相關(guān)蛋白和mTOR信號通路蛋白的表達BA處理MCF7細(xì)胞24 h后，提取總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗(1 ∶1 000)封閉過夜，二抗(1 ∶2 000)室溫孵育1 h，最后用ECL發(fā)光液顯色，暗盒中膠片曝光，顯影、定影后掃描圖像。

2.5細(xì)胞存活率測定將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞接種密度為2×108·L-1，每孔100 μL。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)過夜，次日加入培養(yǎng)液、10 μmol·L-1BA、1×10-3mol·L-13-MA、10 μmol·L-1BA + 1×10-3mol·L-13-MA，每組設(shè)6個平行孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后每孔加入10 μL 5 g·L-1的MTT，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸盡上清，在96孔板中加入100 μL DMSO溶解甲臜，振搖10 min。在酶標(biāo)儀上檢測，測量波長為570 nm，參比波長為690 nm。按照下述公式計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=(樣品組OD值/空白對照組OD值)×100%。

3 結(jié)果

3.1BA誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞發(fā)生自噬AO染色結(jié)果表明(Fig 1A)，10、20、40 μmol·L-1BA作用MCF7細(xì)胞24 h后，橘紅色熒光明顯增多，且呈濃度依賴性，提示細(xì)胞內(nèi)的酸性小囊泡增加。MDC可標(biāo)記與酸性溶酶體結(jié)合的細(xì)胞自噬體結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞儀結(jié)合MDC染色實驗發(fā)現(xiàn)，隨著BA濃度的增加，細(xì)胞熒光強度增強，且呈現(xiàn)很好的劑量依賴性(Fig 1B)，提示BA誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬。Western blot結(jié)果表明(Fig 1C)，BA引起自噬標(biāo)志性蛋白LC3-II增加，這進一步驗證了BA誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞自噬。

3.2BA通過Akt/ERK-mTOR信號通路誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞自噬哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號通路是細(xì)胞自噬的負(fù)調(diào)節(jié)因子。如Fig 2所示，不同濃度的BA(10～40 μmol·L-1)處理細(xì)胞24 h后，p-mTOR蛋白表達降低，而總mTOR蛋白表達略微減少；細(xì)胞內(nèi)p70S6K蛋白絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)的磷酸化水平和4EBP1的磷酸化水平降低，呈很好的劑量依賴性。當(dāng)Akt或ERK1/2磷酸化結(jié)節(jié)性硬化癥基因2(tuberous sclerosis complex 2, TSC2)后，TSC2與TSC1解離，引起mTOR的激活，自噬受到抑制[6]。Western blot結(jié)果顯示，隨著BA濃度升高，Akt 和p-ERK表達降低，呈很好的劑量依賴性(Fig 3)。

3.3自噬抑制劑3-MA可提高BA的細(xì)胞毒作用3-MA是一種廣泛應(yīng)用的細(xì)胞自噬抑制劑，可以抑制PI3K活性。為觀察BA誘導(dǎo)的自噬對細(xì)胞活性的影響，我們用1 mmol·L-13-MA預(yù)處理MCF7細(xì)胞0.5 h，再加入10 μmol·L-1BA處理48 h，通過MTT檢測細(xì)胞的活性。如Fig 4所示，當(dāng)3-MA在1×10-3mol·L-1時，對MCF7細(xì)胞存活率沒有影響，但在與10 μmol·L-1BA聯(lián)合用藥時，細(xì)胞存活率明顯低于單獨使用BA處理的細(xì)胞，即抑制細(xì)胞自噬導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降。提示BA誘導(dǎo)的MCF7細(xì)胞自噬是細(xì)胞的一種自我保護機制。

4 討論

乳腺癌是女性人群中發(fā)病率居首位的惡性腫瘤，全國腫瘤登記中心2015年年報顯示，中國女性乳腺癌年發(fā)病人數(shù)約24.9萬，近10年來發(fā)病一直呈上升趨勢[7]。因此，尋找安全有效的抗乳腺癌藥物具有十分重要的意義。本課題前期研究結(jié)果表明，BA能夠抑制乳腺癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞增殖，并通過線粒體通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]。

Fig 1 BA induces autophagy in MCF7 cells, examined by AO staining (A), MDC staining (B) and Western blot (C)

**P<0.01vscontrol

細(xì)胞自噬是繼凋亡之后，生命科學(xué)最熱門的研究領(lǐng)域之一。目前已有研究報道，某些三萜皂苷可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，但其引起的細(xì)胞自噬反而有助于細(xì)胞逃離損害，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞存活[8-10]。 但BA作用于人乳腺癌細(xì)胞MCF7后，是否產(chǎn)生自噬及其自噬對細(xì)胞的作用尚不明確。本研究結(jié)果表明，不同濃度BA處理細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下觀察到自噬溶酶體等典型的形態(tài)學(xué)變化。與此同時，流式細(xì)胞儀也檢測到自噬溶酶體的出現(xiàn)。當(dāng)自噬發(fā)生時，胞質(zhì)內(nèi)的LC3-I會轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w膜上的LC3-II。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著BA劑量的提高，LC3-II表達逐漸增加。以上結(jié)果表明BA能夠誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞自噬。

Lim等[11]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的發(fā)生與mTOR通路過表達相關(guān)；同時，自噬的誘導(dǎo)與mTOR通路的抑制密切相關(guān)[12]。自噬的誘導(dǎo)通路較多，mTOR是其中經(jīng)典的激活自噬的負(fù)調(diào)節(jié)通路[11]。當(dāng)受到外界影響因子刺激，mTOR蛋白被抑制，從而抑制mTOR活性形式-磷酸化蛋白的形成，進而激活自噬效應(yīng)。齊墩果酸能通過抑制Akt/mTOR通路，誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞PC3自噬[9]。本研究中，BA抑制MCF7細(xì)胞內(nèi)mTOR磷酸化表達，以及mTOR復(fù)合物兩個最主要靶點p70S6K和4EBP1的磷酸化，說明在乳腺癌細(xì)胞MCF7中，BA能通過抑制該通路誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生。mTORC1 的上游通路主要有3條，包括PI3K/Akt/mTORC1 信號通路、Ras/MEK/ERK信號通路、AMPK-mTORC1信號通路[6]。我們檢測了mTOR上游的Akt、p-ERK、ERK和p-AMPK的表達情況，發(fā)現(xiàn)BA可下調(diào)MCF7細(xì)胞中Akt和p-ERK蛋白表達，同時40 μmol·L-1BA可減少總ERK的表達，但是BA不能激活A(yù)MPK，Western blot沒有檢測到p-AMPK表達。

Fig 2 Effects of BA on expression of mTOR pathway*P<0.05, **P<0.01 vs control

腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬后可能會出現(xiàn)兩種不同的結(jié)果：一種是使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境得到穩(wěn)定，保護細(xì)胞逃離損害，維持細(xì)胞存活；另一種是啟動Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡，發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡。有研究顯示，化療藥順鉑及5-氟尿嘧啶作用于腫瘤細(xì)胞后，引起的自噬反而使腫瘤細(xì)胞得以存活，說明自噬的發(fā)生與化療耐藥有關(guān)[13-14]。 自噬抑制劑3-MA能通過阻止自噬體形成，抑制自噬的發(fā)生[15]。在本研究中，用3-MA與BA聯(lián)合作用于MCF7細(xì)胞48 h后，誘導(dǎo)了更明顯的腫瘤細(xì)胞增殖抑制。說明BA引起的自噬是保護性自噬，可部分拮抗BA誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞損傷。

Fig 3 Effects of BA on expression of Akt, p-ERK and ERK*P<0.05, **P<0.01 vs control

Fig 4 Effects of 3-MA on cytotoxicity induced by BA*P<0.05 vs DMSO; ##P<0.01 vs BA

綜上所述，BA可通過抑制Akt和p-ERK蛋白表達，從而抑制mTOR激活，下調(diào)mTOR下游分子p70S6K和4EBP1的磷酸化水平，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平的提高，最終促進了人乳腺癌細(xì)胞MCF7存活。該研究表明，BA和自噬抑制劑聯(lián)合應(yīng)用可更有效地抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，這將為乳腺癌的臨床治療提供新的思路。

(致謝：本研究是在江蘇省中國科學(xué)院植物研究所完成，衷心感謝各位老師和同學(xué)在實驗過程中的幫助與指導(dǎo)。)

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