龔晨雨 陳 昭 邵紅偉 張文峰

(廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院/廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006)

腫瘤免疫治療是指通過(guò)增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞的殺傷能力，同時(shí)阻斷或減少調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的庇護(hù)，從而控制和殺傷腫瘤細(xì)胞[1]。早在100多年前，隨著免疫學(xué)基礎(chǔ)研究的發(fā)展，科學(xué)家就提出了用自身免疫功能殺死腫瘤細(xì)胞來(lái)治療腫瘤的設(shè)想。腫瘤免疫療法始于1981年，Coley等[2]用滅活的膿鏈球菌與黏質(zhì)沙雷氏菌的過(guò)濾混合物來(lái)治療腫瘤并取得了成功。在20世紀(jì)中期，Burnet等[3]和Thomas等[4]提出了“腫瘤的免疫監(jiān)視”理論，認(rèn)為免疫系統(tǒng)可以識(shí)別并清除機(jī)體中出現(xiàn)的突變腫瘤細(xì)胞，奠定了腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)。隨著免疫系統(tǒng)與腫瘤之間相互作用的深入研究，腫瘤免疫治療在黑色素癌、肺癌、胃癌等多類癌癥中都取得令人振奮的臨床進(jìn)展。近年來(lái)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的興起和廣泛應(yīng)用為腫瘤免疫治療研究帶來(lái)了新的發(fā)展機(jī)遇。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR- associated nuclease 9)基因編輯系統(tǒng)是來(lái)源于細(xì)菌和古生菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)，可以有效地對(duì)gRNA(Guide RNA)介導(dǎo)的特定位點(diǎn)DNA進(jìn)行編輯。Cas9蛋白具有核酸內(nèi)切酶的功能，它首先與一個(gè)gRNA結(jié)合，在gRNA序列的引導(dǎo)下可以結(jié)合到DNA靶標(biāo)位置，該位置通常在PAM(Protospacer Adjacent Motif)位點(diǎn)的上游，然后切割目標(biāo)DNA導(dǎo)致雙鏈斷裂(Double- Strand Break，DSB)，真核細(xì)胞的DSB修復(fù)包括同源重組修復(fù)(Homology- directed repair,HDR)和非同源末端連接(Non- homologous end joining,NHEJ)兩種途徑，NHEJ修復(fù)可能導(dǎo)致錯(cuò)誤修復(fù)以及堿基的插入缺失，從而造成移碼突變滅活靶基因，達(dá)到敲除靶基因的目的(圖1)。因相比鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)技術(shù)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator- like effector nucleases，TALENs)技術(shù)具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于不同類型的基因編輯[5- 7]，CRISPR/Cas9在腫瘤免疫治療中也發(fā)揮了重要作用。

1.1在免疫檢查點(diǎn)阻斷療法中的應(yīng)用 程序性死亡分子PD- 1和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(Cytotoxic T lymphocyte- associated antigen- 4,CTLA- 4)等免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)變化會(huì)影響T細(xì)胞活化，并幫助腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，導(dǎo)致T細(xì)胞治療效果不理想。利用針對(duì)免疫檢查點(diǎn)的阻斷抗體可阻斷這些免疫負(fù)調(diào)節(jié)物對(duì)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的抑制作用，能有效提高T細(xì)胞的免疫功能，從而發(fā)揮更好的抗腫瘤功能。

除了傳統(tǒng)的利用人源化單克隆抗體來(lái)阻斷免疫檢查點(diǎn)之外，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)免疫負(fù)調(diào)節(jié)的基因進(jìn)行敲除破壞也可以簡(jiǎn)單有效地達(dá)到同樣的治療效果，為免疫檢查點(diǎn)的阻斷提供了一個(gè)新的方法。例如利用電穿孔的方法將Cas9和sgRNA導(dǎo)入原代T細(xì)胞中敲除PD- 1基因[9]，可導(dǎo)致PD- 1的表達(dá)明顯減少，并且在長(zhǎng)時(shí)間的體外培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)T細(xì)胞活性及增殖能力產(chǎn)生影響；PD- 1基因的敲除消除了對(duì)T細(xì)胞的抑制，從而更好地發(fā)揮抗腫瘤作用。這種新的阻斷方法通常與過(guò)繼性T細(xì)胞免疫療法聯(lián)合使用，可以增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，例如Ren等[10]利用CRISPR/Cas9快速、高效地對(duì)CAR- T細(xì)胞進(jìn)行多基因編輯 ，通過(guò)這種方法得到包括免疫檢查點(diǎn)PD- 1和CTLA- 4在內(nèi)的多基因敲除CAR- T細(xì)胞，效應(yīng)T細(xì)胞中PD- 1和CTLA- 4參與的抑制性通路被有效阻斷，成功提高CAR- T細(xì)胞的反應(yīng)性，從而取得更好的抗腫瘤效果。

圖1 化膿性鏈球菌Cas9- sgRNA復(fù)合物參與RNA介導(dǎo)的真核基因組編輯的基本構(gòu)成[8]Fig.1 Basic constitution of S.pyogenes Cas9- sgRNA complex for participating in RNA mediated eukaryotic genome editing[8]

1.2在過(guò)繼性細(xì)胞治療中的應(yīng)用 過(guò)繼性細(xì)胞治療是一種被動(dòng)免疫治療，即在體外刺激、擴(kuò)增和激活免疫細(xì)胞并回輸患者體內(nèi)，以直接或間接殺傷腫瘤細(xì)胞。其中利用非特異性免疫細(xì)胞進(jìn)行的過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療，包括LAK療法、NK療法及CIK療法[11- 13]。

腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞(Tumor infiltrating lymphocyte,TIL)療法是腫瘤抗原特異性T細(xì)胞治療中的重要組成部分[14]。DC的抗原提呈能力也大大提高了DC- TIL和DC- CIK療法的腫瘤特異性殺傷效果[15]。近年來(lái)，外源基因修飾的T細(xì)胞過(guò)繼性療法，例如特異性T細(xì)胞受體修飾的T細(xì)胞治療(TCR- T)和嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞治療(CAR- T)在抗腫瘤治療的臨床研究中均取得了振奮人心的效果，成為腫瘤過(guò)繼性治療研究的新方向[16]，它們的共同點(diǎn)是在T細(xì)胞表面表達(dá)特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的受體并介導(dǎo)發(fā)生針對(duì)靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

在TCR- T細(xì)胞治療中，由于存在內(nèi)源和外源兩種TCR分子，這種情況容易形成雜合TCR分子(內(nèi)源α鏈與外源β鏈或內(nèi)源β鏈與外源α鏈配對(duì))，從而可能導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生，有效減少雜合TCR分子的形成一直以來(lái)都是TCR- T治療中需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在T細(xì)胞中敲除內(nèi)源性TCR基因可為避免雜合TCR分子形成提供一種簡(jiǎn)單有效的方法。本實(shí)驗(yàn)室一直致力于腫瘤免疫治療的研究，我們前期成功篩選到針對(duì)Survivin點(diǎn)突變抗原肽(H80M)特異性TCRVα4和Vβ7基因，該TCR基因修飾T細(xì)胞后顯示出有效的腫瘤識(shí)別和殺傷作用[17]。我們欲進(jìn)一步通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除內(nèi)源TCR基因，再用腫瘤特異性TCR進(jìn)行修飾，目前已成功構(gòu)建靶向TCR分子β鏈C區(qū)(TRBC)的CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)，并成功破壞內(nèi)源TCR基因[18]。

目前在CAR- T細(xì)胞治療中，主要通過(guò)分離患者自身的T細(xì)胞進(jìn)行個(gè)體化回輸，因受到分離T細(xì)胞的數(shù)量和異體排斥的影響，不利于大規(guī)模臨床應(yīng)用，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建健康人來(lái)源的通用型T細(xì)胞則可避免這種限制(圖2)。Ren等[19]發(fā)現(xiàn)把內(nèi)源性TCR基因敲除的同種異體T細(xì)胞作為通用效應(yīng)細(xì)胞，在不影響CAR- T治療效果同時(shí)可有效避免移植物抗宿主病(GVHD)的出現(xiàn)。進(jìn)一步結(jié)合病毒載體遞送嵌合抗原受體基因和電轉(zhuǎn)CRISPR編輯系統(tǒng)的方法，向健康志愿者的T細(xì)胞中導(dǎo)入靶向內(nèi)源性TCR、β2微球蛋白(B2M)以及PD- 1的多個(gè)sgRNA，得到TCR、HLA Ⅰ類分子和PD- 1表達(dá)缺陷的同種異體CAR- T細(xì)胞，其表現(xiàn)出高效的體內(nèi)抗腫瘤活性，同時(shí)有效減少了宿主機(jī)體對(duì)CAR- T細(xì)胞的免疫排斥和CAR- T細(xì)胞對(duì)宿主的排斥。通用效應(yīng)T細(xì)胞的構(gòu)建極大促進(jìn)了T細(xì)胞治療產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。

1.3在抗體靶向療法中的應(yīng)用 腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)了一些異于正常細(xì)胞的抗原，這些抗原可作為單克隆抗體識(shí)別的靶點(diǎn)，針對(duì)這些靶點(diǎn)的抗體可引起腫瘤細(xì)胞的死亡達(dá)到抗腫瘤目的，目前FDA已批準(zhǔn)的抗體類藥物有抗EGFR抗體、抗HER2抗體、抗VEGF抗體、抗CD20抗體等。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以用來(lái)鑒定和驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞表面的潛在靶點(diǎn)，進(jìn)一步發(fā)展抗體靶向治療。Steinhart等[20]利用CRISPR- Cas9基因編輯技術(shù)在含有RNF43突變的胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中進(jìn)行全基因組篩選，發(fā)現(xiàn)Frizzled- 5受體在促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用；利用特異性結(jié)合Frizzled- 5的抗體能夠在荷瘤小鼠中明顯抑制胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)腫瘤患者來(lái)源的RNF43突變胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞的增殖也存在顯著抑制作用，表明Frizzled- 5有可能成為免疫治療藥物的新靶點(diǎn)。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在抗體的制備中也發(fā)揮重要作用。根據(jù)抗體重鏈C區(qū)氨基酸組成的差異，對(duì)應(yīng)的抗體可分為IgG、IgA、IgM、IgD和IgE五類，每類抗體在激活補(bǔ)體系統(tǒng)、觸發(fā)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用即抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(Antibody dependent cell- mediated cytotoxicity，ADCC)存在著差異，在腫瘤的抗體靶向治療中有著不同應(yīng)用?？贵w類型轉(zhuǎn)換是抗體多樣化中的重要一環(huán)，B細(xì)胞特異性胞苷去氨酶(Activation- induced dea minase，AID)起始了抗體類型轉(zhuǎn)換過(guò)程，Ig基因發(fā)生類別轉(zhuǎn)換重組(Class switch recombination ，CSR)最關(guān)鍵的步驟是DNA的雙鏈斷裂，通常情況下雙鏈斷裂是由B細(xì)胞特異性酶如重組激活基因蛋白1/2(RAG 1/2)和AID啟動(dòng)。哈佛醫(yī)學(xué)院的Cheong等[21]首次利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功編輯了小鼠和人的免疫球蛋白(Ig)基因，研究者用CRISPR/Cas9介導(dǎo)IgM+小鼠B細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞以及人類B細(xì)胞的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)基因高效快速地產(chǎn)生雙鏈斷裂，促使發(fā)生類別轉(zhuǎn)換重組，實(shí)現(xiàn)從IgM到IgG再到IgA的抗體類別轉(zhuǎn)換。因此基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，可以針對(duì)B細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞重鏈恒定區(qū)基因進(jìn)行靶向編輯，從而簡(jiǎn)單高效地獲得特定類型的抗體。

圖2 通用效應(yīng)T細(xì)胞用于過(guò)繼性細(xì)胞治療Fig.2 Universal effective T cells for adoptive cell therapy

抗體的抗原結(jié)合片段(Fragment of antigen binding，F(xiàn)ab)因其分子量小、更易滲透腫瘤組織、容易與其他藥物偶聯(lián)等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤的抗體靶向治療中有著更廣泛的應(yīng)用。研究人員目前已利用CRISPR刪除小鼠雜交瘤細(xì)胞IgH的Fc段編碼區(qū)基因，得到只分泌抗體Fab片段的雜交瘤細(xì)胞，這種方法極大地簡(jiǎn)化了目前基于蛋白酶切割和純化得到目的Fab片段的復(fù)雜工藝(圖3)。

圖3 CRISPR- Cas9介導(dǎo)小鼠雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)Fab片段[21]Fig.3 Generation of Fab fragments by CRISPR- Cas9 system in mouse hybridomas[21]

2 展望

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)因其操作簡(jiǎn)單、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)逐漸被許多研究者們作為基因編輯的首選方法，在腫瘤免疫治療中可用來(lái)達(dá)到敲除內(nèi)源性基因、促使基因發(fā)生重排等目的。但是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用于腫瘤免疫治療的臨床應(yīng)用中還存在著諸多待完善的問(wèn)題。首先是CRISPR/Cas9系統(tǒng)在免疫細(xì)胞中的遞送效率問(wèn)題。脂質(zhì)體法、磷酸鈣法等常規(guī)方法難以實(shí)現(xiàn)針對(duì)免疫細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染，目前常用電穿孔法將CRISPR/Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞，但是電穿孔對(duì)細(xì)胞的損傷很大，電轉(zhuǎn)處理后細(xì)胞的活力也會(huì)降低，對(duì)于免疫細(xì)胞來(lái)說(shuō)回輸體內(nèi)后達(dá)不到理想的治療效果。病毒載體如慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體在體外轉(zhuǎn)染中應(yīng)用比較多，考慮到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體整合免疫細(xì)胞染色體帶來(lái)的致瘤風(fēng)險(xiǎn)，腺病毒載體因具有較高的安全性及較好的轉(zhuǎn)染效率等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤的免疫治療中具有廣泛應(yīng)用前景。近期Stephan博士開(kāi)發(fā)出可傳遞CAR編碼基因的生物降解納米顆粒，從而實(shí)現(xiàn)CAR基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)染，相比較傳統(tǒng)的CAR- T制備過(guò)程，該方法要顯得更為簡(jiǎn)單安全、艱巨而耗時(shí)的T細(xì)胞編程步驟都是在體內(nèi)發(fā)生[22]。在未來(lái)的免疫細(xì)胞治療中，可研發(fā)T細(xì)胞靶向性病毒載體，利用其介導(dǎo)TCR或CAR基因直接血液給藥，從而實(shí)現(xiàn)TCR- T或CAR- T的治療。

腫瘤過(guò)繼性免疫細(xì)胞治療中另一個(gè)影響治療效果的重要因素即靶細(xì)胞的選擇，例如T細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，TCR基因或CAR基因?qū)氩煌琓細(xì)胞亞群的抗腫瘤效果存在明顯差異，其中幼稚性T細(xì)胞(TN)、干細(xì)胞樣記憶性T細(xì)胞(TSCM)和中樞記憶性T細(xì)胞(TCM)表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤活性和更長(zhǎng)的存活時(shí)間[23,24]。因此在未來(lái)的免疫細(xì)胞治療中，可將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與靶向性病毒載體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)在以上這些細(xì)胞亞群的有效基因編輯，進(jìn)一步提高臨床治療效果。

脫靶問(wèn)題一直以來(lái)是阻礙CRISPR/Cas9臨床應(yīng)用的重要因素之一，研究者們?cè)谶@一領(lǐng)域也做了許多努力來(lái)降低脫靶效率，例如對(duì)Cas9進(jìn)行突變獲得只具有單切口酶活性的dCas9[25]，這種由兩條sgRNA控制靶向切割DNA形成雙鏈斷裂的方法可極大地降低脫靶率。類似地，將野生型SpCas9其中4個(gè)氨基酸進(jìn)行替換得到的高保真Cas9(SpCas9- HF1)，能將全基因組脫靶率降低到目前最低檢出限以下[26]。另外，研究表明Cas9蛋白在靶細(xì)胞中長(zhǎng)時(shí)間高強(qiáng)度的表達(dá)會(huì)明顯增加CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效率，通過(guò)設(shè)計(jì)光照可逆調(diào)控Cas9的活性，從而有效減少Cas9蛋白的非特異性切割，降低了脫靶效率[27]。

綜上所述，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤免疫治療中擔(dān)任了很重要的角色，我們可以期待這一編輯系統(tǒng)的進(jìn)一步完善從而在臨床上發(fā)揮更出色的應(yīng)用。

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