龔晨雨 陳 昭 邵紅偉 張文峰

(廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院/廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點實驗室，廣州 510006)

腫瘤免疫治療是指通過增強效應(yīng)細胞的殺傷能力，同時阻斷或減少調(diào)節(jié)性免疫細胞對腫瘤的庇護，從而控制和殺傷腫瘤細胞[1]。早在100多年前，隨著免疫學(xué)基礎(chǔ)研究的發(fā)展，科學(xué)家就提出了用自身免疫功能殺死腫瘤細胞來治療腫瘤的設(shè)想。腫瘤免疫療法始于1981年，Coley等[2]用滅活的膿鏈球菌與黏質(zhì)沙雷氏菌的過濾混合物來治療腫瘤并取得了成功。在20世紀中期，Burnet等[3]和Thomas等[4]提出了“腫瘤的免疫監(jiān)視”理論，認為免疫系統(tǒng)可以識別并清除機體中出現(xiàn)的突變腫瘤細胞，奠定了腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)。隨著免疫系統(tǒng)與腫瘤之間相互作用的深入研究，腫瘤免疫治療在黑色素癌、肺癌、胃癌等多類癌癥中都取得令人振奮的臨床進展。近年來CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的興起和廣泛應(yīng)用為腫瘤免疫治療研究帶來了新的發(fā)展機遇。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR- associated nuclease 9)基因編輯系統(tǒng)是來源于細菌和古生菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)，可以有效地對gRNA(Guide RNA)介導(dǎo)的特定位點DNA進行編輯。Cas9蛋白具有核酸內(nèi)切酶的功能，它首先與一個gRNA結(jié)合，在gRNA序列的引導(dǎo)下可以結(jié)合到DNA靶標(biāo)位置，該位置通常在PAM(Protospacer Adjacent Motif)位點的上游，然后切割目標(biāo)DNA導(dǎo)致雙鏈斷裂(Double- Strand Break，DSB)，真核細胞的DSB修復(fù)包括同源重組修復(fù)(Homology- directed repair,HDR)和非同源末端連接(Non- homologous end joining,NHEJ)兩種途徑，NHEJ修復(fù)可能導(dǎo)致錯誤修復(fù)以及堿基的插入缺失，從而造成移碼突變滅活靶基因，達到敲除靶基因的目的(圖1)。因相比鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)技術(shù)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator- like effector nucleases，TALENs)技術(shù)具有設(shè)計簡單、操作簡便等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于不同類型的基因編輯[5- 7]，CRISPR/Cas9在腫瘤免疫治療中也發(fā)揮了重要作用。

1.1在免疫檢查點阻斷療法中的應(yīng)用 程序性死亡分子PD- 1和細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4(Cytotoxic T lymphocyte- associated antigen- 4,CTLA- 4)等免疫檢查點的表達變化會影響T細胞活化，并幫助腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸，導(dǎo)致T細胞治療效果不理想。利用針對免疫檢查點的阻斷抗體可阻斷這些免疫負調(diào)節(jié)物對T細胞免疫應(yīng)答的抑制作用，能有效提高T細胞的免疫功能，從而發(fā)揮更好的抗腫瘤功能。

除了傳統(tǒng)的利用人源化單克隆抗體來阻斷免疫檢查點之外，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對免疫負調(diào)節(jié)的基因進行敲除破壞也可以簡單有效地達到同樣的治療效果，為免疫檢查點的阻斷提供了一個新的方法。例如利用電穿孔的方法將Cas9和sgRNA導(dǎo)入原代T細胞中敲除PD- 1基因[9]，可導(dǎo)致PD- 1的表達明顯減少，并且在長時間的體外培養(yǎng)過程中沒有發(fā)現(xiàn)對T細胞活性及增殖能力產(chǎn)生影響；PD- 1基因的敲除消除了對T細胞的抑制，從而更好地發(fā)揮抗腫瘤作用。這種新的阻斷方法通常與過繼性T細胞免疫療法聯(lián)合使用，可以增強免疫細胞的活性，例如Ren等[10]利用CRISPR/Cas9快速、高效地對CAR- T細胞進行多基因編輯 ，通過這種方法得到包括免疫檢查點PD- 1和CTLA- 4在內(nèi)的多基因敲除CAR- T細胞，效應(yīng)T細胞中PD- 1和CTLA- 4參與的抑制性通路被有效阻斷，成功提高CAR- T細胞的反應(yīng)性，從而取得更好的抗腫瘤效果。

圖1 化膿性鏈球菌Cas9- sgRNA復(fù)合物參與RNA介導(dǎo)的真核基因組編輯的基本構(gòu)成[8]Fig.1 Basic constitution of S.pyogenes Cas9- sgRNA complex for participating in RNA mediated eukaryotic genome editing[8]

1.2在過繼性細胞治療中的應(yīng)用 過繼性細胞治療是一種被動免疫治療，即在體外刺激、擴增和激活免疫細胞并回輸患者體內(nèi)，以直接或間接殺傷腫瘤細胞。其中利用非特異性免疫細胞進行的過繼性細胞免疫治療，包括LAK療法、NK療法及CIK療法[11- 13]。

腫瘤浸潤細胞(Tumor infiltrating lymphocyte,TIL)療法是腫瘤抗原特異性T細胞治療中的重要組成部分[14]。DC的抗原提呈能力也大大提高了DC- TIL和DC- CIK療法的腫瘤特異性殺傷效果[15]。近年來，外源基因修飾的T細胞過繼性療法，例如特異性T細胞受體修飾的T細胞治療(TCR- T)和嵌合抗原受體修飾的T細胞治療(CAR- T)在抗腫瘤治療的臨床研究中均取得了振奮人心的效果，成為腫瘤過繼性治療研究的新方向[16]，它們的共同點是在T細胞表面表達特異識別腫瘤細胞的受體并介導(dǎo)發(fā)生針對靶細胞的免疫應(yīng)答。

在TCR- T細胞治療中，由于存在內(nèi)源和外源兩種TCR分子，這種情況容易形成雜合TCR分子(內(nèi)源α鏈與外源β鏈或內(nèi)源β鏈與外源α鏈配對)，從而可能導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生，有效減少雜合TCR分子的形成一直以來都是TCR- T治療中需要解決的關(guān)鍵問題。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在T細胞中敲除內(nèi)源性TCR基因可為避免雜合TCR分子形成提供一種簡單有效的方法。本實驗室一直致力于腫瘤免疫治療的研究，我們前期成功篩選到針對Survivin點突變抗原肽(H80M)特異性TCRVα4和Vβ7基因，該TCR基因修飾T細胞后顯示出有效的腫瘤識別和殺傷作用[17]。我們欲進一步通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除內(nèi)源TCR基因，再用腫瘤特異性TCR進行修飾，目前已成功構(gòu)建靶向TCR分子β鏈C區(qū)(TRBC)的CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)，并成功破壞內(nèi)源TCR基因[18]。

目前在CAR- T細胞治療中，主要通過分離患者自身的T細胞進行個體化回輸，因受到分離T細胞的數(shù)量和異體排斥的影響，不利于大規(guī)模臨床應(yīng)用，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建健康人來源的通用型T細胞則可避免這種限制(圖2)。Ren等[19]發(fā)現(xiàn)把內(nèi)源性TCR基因敲除的同種異體T細胞作為通用效應(yīng)細胞，在不影響CAR- T治療效果同時可有效避免移植物抗宿主病(GVHD)的出現(xiàn)。進一步結(jié)合病毒載體遞送嵌合抗原受體基因和電轉(zhuǎn)CRISPR編輯系統(tǒng)的方法，向健康志愿者的T細胞中導(dǎo)入靶向內(nèi)源性TCR、β2微球蛋白(B2M)以及PD- 1的多個sgRNA，得到TCR、HLA Ⅰ類分子和PD- 1表達缺陷的同種異體CAR- T細胞，其表現(xiàn)出高效的體內(nèi)抗腫瘤活性，同時有效減少了宿主機體對CAR- T細胞的免疫排斥和CAR- T細胞對宿主的排斥。通用效應(yīng)T細胞的構(gòu)建極大促進了T細胞治療產(chǎn)業(yè)化的進程。

1.3在抗體靶向療法中的應(yīng)用 腫瘤細胞表面表達了一些異于正常細胞的抗原，這些抗原可作為單克隆抗體識別的靶點，針對這些靶點的抗體可引起腫瘤細胞的死亡達到抗腫瘤目的，目前FDA已批準(zhǔn)的抗體類藥物有抗EGFR抗體、抗HER2抗體、抗VEGF抗體、抗CD20抗體等。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以用來鑒定和驗證腫瘤細胞表面的潛在靶點，進一步發(fā)展抗體靶向治療。Steinhart等[20]利用CRISPR- Cas9基因編輯技術(shù)在含有RNF43突變的胰腺導(dǎo)管腺癌細胞中進行全基因組篩選，發(fā)現(xiàn)Frizzled- 5受體在促進胰腺癌細胞生長中發(fā)揮關(guān)鍵作用；利用特異性結(jié)合Frizzled- 5的抗體能夠在荷瘤小鼠中明顯抑制胰腺導(dǎo)管腺癌細胞生長，對腫瘤患者來源的RNF43突變胰腺導(dǎo)管腺癌細胞的增殖也存在顯著抑制作用，表明Frizzled- 5有可能成為免疫治療藥物的新靶點。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在抗體的制備中也發(fā)揮重要作用。根據(jù)抗體重鏈C區(qū)氨基酸組成的差異，對應(yīng)的抗體可分為IgG、IgA、IgM、IgD和IgE五類，每類抗體在激活補體系統(tǒng)、觸發(fā)效應(yīng)細胞對靶細胞的殺傷作用即抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(Antibody dependent cell- mediated cytotoxicity，ADCC)存在著差異，在腫瘤的抗體靶向治療中有著不同應(yīng)用。抗體類型轉(zhuǎn)換是抗體多樣化中的重要一環(huán)，B細胞特異性胞苷去氨酶(Activation- induced dea minase，AID)起始了抗體類型轉(zhuǎn)換過程，Ig基因發(fā)生類別轉(zhuǎn)換重組(Class switch recombination ，CSR)最關(guān)鍵的步驟是DNA的雙鏈斷裂，通常情況下雙鏈斷裂是由B細胞特異性酶如重組激活基因蛋白1/2(RAG 1/2)和AID啟動。哈佛醫(yī)學(xué)院的Cheong等[21]首次利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功編輯了小鼠和人的免疫球蛋白(Ig)基因，研究者用CRISPR/Cas9介導(dǎo)IgM+小鼠B細胞、雜交瘤細胞以及人類B細胞的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)基因高效快速地產(chǎn)生雙鏈斷裂，促使發(fā)生類別轉(zhuǎn)換重組，實現(xiàn)從IgM到IgG再到IgA的抗體類別轉(zhuǎn)換。因此基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，可以針對B細胞或雜交瘤細胞重鏈恒定區(qū)基因進行靶向編輯，從而簡單高效地獲得特定類型的抗體。

圖2 通用效應(yīng)T細胞用于過繼性細胞治療Fig.2 Universal effective T cells for adoptive cell therapy

抗體的抗原結(jié)合片段(Fragment of antigen binding，F(xiàn)ab)因其分子量小、更易滲透腫瘤組織、容易與其他藥物偶聯(lián)等優(yōu)點，在腫瘤的抗體靶向治療中有著更廣泛的應(yīng)用。研究人員目前已利用CRISPR刪除小鼠雜交瘤細胞IgH的Fc段編碼區(qū)基因，得到只分泌抗體Fab片段的雜交瘤細胞，這種方法極大地簡化了目前基于蛋白酶切割和純化得到目的Fab片段的復(fù)雜工藝(圖3)。

圖3 CRISPR- Cas9介導(dǎo)小鼠雜交瘤細胞生產(chǎn)Fab片段[21]Fig.3 Generation of Fab fragments by CRISPR- Cas9 system in mouse hybridomas[21]

2 展望

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)因其操作簡單、快速、高效等優(yōu)點逐漸被許多研究者們作為基因編輯的首選方法，在腫瘤免疫治療中可用來達到敲除內(nèi)源性基因、促使基因發(fā)生重排等目的。但是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用于腫瘤免疫治療的臨床應(yīng)用中還存在著諸多待完善的問題。首先是CRISPR/Cas9系統(tǒng)在免疫細胞中的遞送效率問題。脂質(zhì)體法、磷酸鈣法等常規(guī)方法難以實現(xiàn)針對免疫細胞的高效轉(zhuǎn)染，目前常用電穿孔法將CRISPR/Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)入目的細胞，但是電穿孔對細胞的損傷很大，電轉(zhuǎn)處理后細胞的活力也會降低，對于免疫細胞來說回輸體內(nèi)后達不到理想的治療效果。病毒載體如慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體在體外轉(zhuǎn)染中應(yīng)用比較多，考慮到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體整合免疫細胞染色體帶來的致瘤風(fēng)險，腺病毒載體因具有較高的安全性及較好的轉(zhuǎn)染效率等優(yōu)點，在腫瘤的免疫治療中具有廣泛應(yīng)用前景。近期Stephan博士開發(fā)出可傳遞CAR編碼基因的生物降解納米顆粒，從而實現(xiàn)CAR基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)染，相比較傳統(tǒng)的CAR- T制備過程，該方法要顯得更為簡單安全、艱巨而耗時的T細胞編程步驟都是在體內(nèi)發(fā)生[22]。在未來的免疫細胞治療中，可研發(fā)T細胞靶向性病毒載體，利用其介導(dǎo)TCR或CAR基因直接血液給藥，從而實現(xiàn)TCR- T或CAR- T的治療。

腫瘤過繼性免疫細胞治療中另一個影響治療效果的重要因素即靶細胞的選擇，例如T細胞具有高度異質(zhì)性，TCR基因或CAR基因?qū)氩煌琓細胞亞群的抗腫瘤效果存在明顯差異，其中幼稚性T細胞(TN)、干細胞樣記憶性T細胞(TSCM)和中樞記憶性T細胞(TCM)表現(xiàn)出更強的抗腫瘤活性和更長的存活時間[23,24]。因此在未來的免疫細胞治療中，可將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與靶向性病毒載體結(jié)合，實現(xiàn)在以上這些細胞亞群的有效基因編輯，進一步提高臨床治療效果。

脫靶問題一直以來是阻礙CRISPR/Cas9臨床應(yīng)用的重要因素之一，研究者們在這一領(lǐng)域也做了許多努力來降低脫靶效率，例如對Cas9進行突變獲得只具有單切口酶活性的dCas9[25]，這種由兩條sgRNA控制靶向切割DNA形成雙鏈斷裂的方法可極大地降低脫靶率。類似地，將野生型SpCas9其中4個氨基酸進行替換得到的高保真Cas9(SpCas9- HF1)，能將全基因組脫靶率降低到目前最低檢出限以下[26]。另外，研究表明Cas9蛋白在靶細胞中長時間高強度的表達會明顯增加CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效率，通過設(shè)計光照可逆調(diào)控Cas9的活性，從而有效減少Cas9蛋白的非特異性切割，降低了脫靶效率[27]。

綜上所述，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤免疫治療中擔(dān)任了很重要的角色，我們可以期待這一編輯系統(tǒng)的進一步完善從而在臨床上發(fā)揮更出色的應(yīng)用。

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