程瑞娟 吳春玲 肖衛(wèi)國(guó)

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，沈陽(yáng) 110001)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是最常見(jiàn)的炎性關(guān)節(jié)病，RA在中國(guó)的發(fā)病率約為0.3%[1]，約30%的RA患者存在肺間質(zhì)受累，男性多于女性，且可為首發(fā)表現(xiàn)。RA引起的肺間質(zhì)病變(Interstitial lung disease，ILD)晚期可發(fā)展為肺間質(zhì)纖維化(Interstitial pulmonary fibrosis，IPF)，是導(dǎo)致患者預(yù)后不良和死亡的主要因素之一。

趨化因子(Chemokine)CCL19和CCL21是趨化因子受體CCR7的特異性配體，在趨化免疫細(xì)胞遷移，維持免疫穩(wěn)態(tài)中具有重要的作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)它們還參與了血管生成、慢性炎癥、自身免疫性疾病的發(fā)生以及腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移[2]。許多研究證實(shí)，CCR7在RA患者的外周血，滑膜組織及滑液中的表達(dá)較正常人增高[3- 6]，且與炎癥和疾病嚴(yán)重程度正相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)IL- 6與CCL21與特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化有關(guān)[7]，而且CD68+CCR7+的巨噬細(xì)胞在肺泡纖維化病變周圍的新生淋巴管附近聚集[8]，肺泡的纖維化很可能與CCR7通路有關(guān)[9]。對(duì)于彌漫性肺泡損傷的研究顯示，肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞表面CCR7高表達(dá)[10]。那么CCR7- CCL21/CCL19通路是否參與了RA的肺間質(zhì)病變呢？目前關(guān)于RA合并肺間質(zhì)疾病與血清中CCL21和CCL19水平之間的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)測(cè)定合并肺間質(zhì)改變的RA患者，肺間質(zhì)未受累的RA患者，特發(fā)性間質(zhì)性肺炎(Idiopathic interstitial pneumonia，IIP)患者與正常人血清中CCL21和CCL19水平的差異，初步探討CCL21與CCL19在RA相關(guān)的肺間質(zhì)改變中所起的作用。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象及分組 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者62例，診斷均符合1987年ACR關(guān)于RA的分類標(biāo)準(zhǔn)和(或)2009年EULAR和ACR聯(lián)合提出的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)肺HRCT及肺功能加彌散測(cè)定判斷是否合并肺間質(zhì)改變，將其分為兩組，即RA肺間質(zhì)未受累組,記為RA- ILD組，共34例，其中男性4例，女性30例，年齡21～89歲，平均(51.53±15.37)歲；RA合并肺間質(zhì)改變組，記為RA+ILD組，共28例，其中男性6例，女性22例，年齡29～84歲，平均(62.04±10.29)歲；特發(fā)性間質(zhì)性肺炎(IIF)的患者18例，均符合2002年ATS和ERS關(guān)于ILD的分類標(biāo)準(zhǔn)，其中男性8例，女性10例，年齡27～74歲，平均(57.61±11.69)歲；健康對(duì)照組選自同期我院體檢合格的20例正常人，其中男性5例，女性15例，年齡24～47歲，平均(30.20±6.65)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：所有患者及健康對(duì)照均排除妊娠，其他自身免疫疾病、腫瘤、高血壓、冠心病和糖尿病病史及乙肝、結(jié)核、HIV、梅毒等傳染病史。所有患者及健康對(duì)照均知情同意。

1.2方法

1.2.1血標(biāo)本留取及儲(chǔ)存 收集2016年5月至2017年3月于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科和呼吸科住院的患者的晨起空腹外周血標(biāo)本，分離血清并保存于-80℃冰箱。將血清10倍稀釋后，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，使用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處讀數(shù)，測(cè)出樣本的OD值，通過(guò)curve expert 1.4軟件，計(jì)算出樣品中的CCL21和CCL19濃度。 檢測(cè)人血清CCL21和CCL19的ELISA試劑盒均購(gòu)自Cloud- Clone Corp公司，PBS磷酸鹽緩沖液購(gòu)自Solarbio公司，移液器購(gòu)于Bio Pette公司，多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自TECAN公司。

1.2.2臨床資料及實(shí)驗(yàn)室資料收集 記錄RA患者的性別、年齡、病程、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、ESR、CRP、D- 二聚體、FIB、RF、免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)、白蛋白、補(bǔ)體(C3、C4)、血常規(guī)(WBC、Hb、plt)、ANCA、CCP、T細(xì)胞亞群(CD3、CD4、CD8)、血?dú)夥治?PaO2、PaCO2、pH、血氧飽和度)、肺功能加彌散(FEV1、FVC、FEV1/FVC、DLCO)、肺HRCT等臨床資料，計(jì)算出BMI、DAS28- ESR和DAS28- CRP并記錄。

2 結(jié)果

2.1CCL21和CCL19在RA患者血清中的表達(dá) ELISA結(jié)果顯示，RA患者血清中的CCL21水平高于正常人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(283.649 6±144.214 1)pg/ml vs (171.877 4±54.525 8) pg/ml，P<0.05]；RA患者血清中的CCL19水平也高于正常人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1 126.704 9±1 251.000 2) pg/ml vs (168.205 1±76.680 2) pg/ml，P<0.01]。

圖1 各組血清中CCL21的表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of CCL21 in serum of all groupsNote: *.P<0.05;**.P<0.01.

圖2 各組血清中CCL19的表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of CCL19 in serum of all groupsNote: **.P<0.01.

2.2CCL21與肺間質(zhì)改變的關(guān)系 ELISA結(jié)果顯示，合并ILD的RA患者血清中CCL21濃度高于無(wú)ILD的RA，高于正常人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(332.715 2±134.750 3 )pg/ml vs (243.242 6±140.936 5) pg/ml，P<0.05；(332.715 2±134.750 3)pg/ml vs(171.877 4±54.525 8)pg/ml，P<0.01]，IIP患者血清中的CCL21水平高于正常人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(324.125 6±175.107 4)pg/ml vs (171.877 4±54.525 8)pg/ml，P<0.01]，如圖1。

2.3CCL19與肺間質(zhì)改變的關(guān)系 ELISA結(jié)果顯示，無(wú)ILD的RA患者血清中CCL19濃度高于合并ILD的RA，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1 396.744 0±1 523.929 4) pg/ml vs (835.893 5±800.017 4) pg/ml，P>0.05]；合并ILD的RA患者血清中CCL19濃度高于IIP組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(835.893 5±800.017 4)pg/ml vs (389.891 2±262.350 4)pg/ml，P>0.05]。無(wú)ILD的RA患者及合并ILD的RA血清中CCL19均高于正常人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1 396.744 0±1 523.929 4)pg/ml vs (168.205 1±76.680 2)pg/ml，P<0.01；(835.893 5±800.017 4)pg/ml vs(168.205 1±76.680 2)pg/ml，P<0.01]，如圖2。

2.4CCL21、CCL19與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析 將RA患者按DAS28分為中疾病活動(dòng)度組和高疾病活動(dòng)度組，按CCP是否陽(yáng)性分組，按ANCA是否陽(yáng)性分組，按RF是否陽(yáng)性分組后對(duì)比血清中的CCL21和CCL19的濃度，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；按性別分組后，男性血清中的CCL21水平高于女性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(375.389 1±125.856 9)pg/ml vs (268.071 1±142.324 9)pg/ml，P<0.05]。

Pearson和Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)分析后顯示，RA患者血清中CCL21水平與白蛋白水平呈弱的負(fù)相關(guān)(r=-0.280，P<0.05)，與BMI呈中度負(fù)相關(guān)(r=-0.605，P<0.05)；RA患者血清中CCL19水平與C4水平呈中度負(fù)相關(guān)(r=-0.326，P<0.05)，與D二聚體水平呈中度正相關(guān)(r=0.592，P<0.05)。RA患者血清中的CCL21和CCL19水平與年齡、病程、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、ESR、CRP、DAS28、RF、Ig、WBC、Hb、plt、CCP等指標(biāo)無(wú)相關(guān)性。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，RA患者血清中的CCL21和CCL19水平均高于正常人，說(shuō)明CCL21和CCL19可能參與了RA的發(fā)病。合并間質(zhì)性肺炎的RA患者血清中CCL21水平高于無(wú)肺間質(zhì)受累的RA患者，且高于正常人，而血清CCL19水平未發(fā)現(xiàn)此差異。提示CCL21而不是CCL19可能參與了RA的肺間質(zhì)改變過(guò)程。近年來(lái)，結(jié)締組織病相關(guān)的肺纖維化受到人們的廣泛關(guān)注，RA合并間質(zhì)性肺炎多預(yù)后不良[11]，但是目前治療RA合并的肺纖維化沒(méi)有特效的治療藥物，需使用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，適應(yīng)證的局限性及療效的不確切性的同時(shí)還存在一系列相關(guān)的副作用，不僅加重了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還給患者造成了巨大的精神壓力。Pierce等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，阻斷特發(fā)性肺纖維化患者的成纖維細(xì)胞表面的CCR7受體，可抑制肺成纖維細(xì)胞遷移和增殖，這為治療肺間質(zhì)纖維化提供了新的思路。我們的研究發(fā)現(xiàn)，IIP患者與合并間質(zhì)性肺炎的RA患者血清中的CCL21水平均高于正常人，二者的CCL21水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說(shuō)明CCL21可能參與了IIP和RA相關(guān)的肺間質(zhì)疾病的發(fā)病過(guò)程。肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生是一個(gè)多種細(xì)胞因子共同參與的復(fù)雜機(jī)制，CCL21是否是兩種間質(zhì)性肺病的共同通路仍需要我們繼續(xù)研究。

我們還發(fā)現(xiàn)男性RA患者血清中的CCL21水平高于女性，這可能是造成男性RA患者間質(zhì)性肺炎發(fā)生率高于女性患者的原因之一。我們知道，補(bǔ)體系統(tǒng)參與的最常見(jiàn)的風(fēng)濕性疾病就是系統(tǒng)性紅斑狼瘡和RA，人體內(nèi)的補(bǔ)體主要在肝臟合成，補(bǔ)體系統(tǒng)在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起重要作用，自身抗體的產(chǎn)生可以激活補(bǔ)體系統(tǒng)，補(bǔ)體反應(yīng)釋放的補(bǔ)體片段可激活免疫細(xì)胞并觸發(fā)炎癥反應(yīng)。而趨化因子與其受體通過(guò)固有免疫和獲得性免疫過(guò)程參與了宿主的防御機(jī)制，同時(shí)也參與了炎癥和疾病發(fā)生[13]。關(guān)于CCL19與補(bǔ)體系統(tǒng)關(guān)系的認(rèn)知還有待進(jìn)一步研究。一些研究指出，RA患者的血液存在高凝狀態(tài)，凝血- 纖溶系統(tǒng)可能在RA病情進(jìn)展中起一定作用，我們發(fā)現(xiàn)血清CCL19與D- 二聚體水平呈中度正相關(guān)，說(shuō)明CCL19可能在某種程度上與凝血- 纖溶系統(tǒng)激活相關(guān)。

許多研究發(fā)現(xiàn)，RA在出現(xiàn)有臨床癥狀的關(guān)節(jié)炎之前，就已經(jīng)存在滑膜炎癥，血清中就有RF和CCP等自身抗體出現(xiàn)，滑膜活檢也證實(shí)早期RA無(wú)癥狀關(guān)節(jié)標(biāo)本中淋巴細(xì)胞及炎性因子高于正常人，因此可能會(huì)造成炎癥程度與病程的不平行。RA患者以中青年為發(fā)病主體，80%的患者于35～50歲發(fā)病，女性患者的數(shù)約為男性的3倍[14]。X線普查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，65歲以上人群的放射學(xué)骨關(guān)節(jié)炎患病率超過(guò)50 %，本研究中患者的年齡為(55.56±14.84)歲，大部分RA患者都合并有骨關(guān)節(jié)炎，有文獻(xiàn)報(bào)道RA發(fā)病初期的關(guān)節(jié)損傷一定程度上是由于骨關(guān)節(jié)炎造成的[15]，這可能是造成CCL19和CCL21的水平與壓痛關(guān)節(jié)數(shù)，腫脹關(guān)節(jié)數(shù)及DAS28評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的原因之一。

總之，RA患者血清中的CCL21和CCL19水平均高于正常人，CCL21和CCL19可能參與了RA的發(fā)病，研究趨化因子CCL21和CCL19的水平與RA的關(guān)系，有助于為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的靶向治療提供新的依據(jù)，為進(jìn)一步的臨床研究提供參考。IIP與合并間質(zhì)性肺炎的RA患者血清中的CCL21水平均高于正常人，CCL21可能參與了RA的肺間質(zhì)改變過(guò)程。若CCL21是兩種間質(zhì)性肺病的共同通路，將為治療IIP的藥物應(yīng)用于合并間質(zhì)性肺炎的RA患者提供依據(jù)，CCR7- CCL21/CCL19軸有望成為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的新的治療靶點(diǎn)。

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