趙 穎 王紅月 竇海川 肖慶飛 趙悅竹 顧春梅④

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院人獸共患病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130062)

蠕蟲(chóng)(多細(xì)胞寄生蟲(chóng))與他們的脊椎動(dòng)物適應(yīng)性共生和進(jìn)化已達(dá)數(shù)億年或更久，且不言而喻的多以丑陋骯臟、危害宿主健康的面目出現(xiàn)。但隨著“衛(wèi)生假說(shuō)”的提出，近年來(lái)越來(lái)越多的研究顯示寄生蟲(chóng)尤其蠕蟲(chóng)可有效預(yù)防和治療日益嚴(yán)重的免疫失衡性疾病[1]。在保護(hù)生物學(xué)多樣性層面，在一定程度上更印證了黑格爾“凡是存在的即是合理的”，即寄生蟲(chóng)在造成危害的同時(shí)給機(jī)體帶來(lái)了意想不到的益處，并預(yù)言對(duì)寄生蟲(chóng)的利用可能比防治具有同等或更具前景和誘惑力。

蠕蟲(chóng)中的旋毛形線蟲(chóng)(Trichinellaspiralis，T.spiralis)作用部位直接起源于腸道，最終定植于肌肉。因此，腸道局部乃至全身的免疫反應(yīng)都與旋毛蟲(chóng)分泌的許多天然的有益抗原物質(zhì)關(guān)系密切。

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)主要包括克羅恩病(Crohn′s disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)[2,3]。它們是一種典型的腸道黏膜免疫失衡性疾病，呈慢性病程，并且易反復(fù)發(fā)作，為頑固難治的消化道疾病。免疫反應(yīng)紊亂是IBD重要發(fā)病原因之一，以腸黏膜的炎癥和損傷為主要特征，并伴隨腸內(nèi)外的一些自身免疫性反應(yīng)?；颊哌M(jìn)一步發(fā)展為結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)是正常人的6倍，并且惡變率很高。在中國(guó)，迅猛發(fā)展的經(jīng)濟(jì)和逐漸提高的衛(wèi)生狀況，使IBD的發(fā)病率也在逐年增長(zhǎng)[4]。基于“衛(wèi)生假說(shuō)”中腸道蠕蟲(chóng)與IBD的關(guān)聯(lián)性[5,6]，一直以來(lái)，我們的研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了關(guān)于旋毛蟲(chóng)作為生物免疫調(diào)節(jié)劑防治炎癥性腸病的多項(xiàng)研究。結(jié)果，預(yù)先感染旋毛蟲(chóng)對(duì)三硝基苯磺酸(Trinitrobenzesulfonic,TNBS)模型小鼠的腸道具有保護(hù)作用[7]，本研究擬通過(guò)旋毛蟲(chóng)對(duì)TNBS和噁唑酮(Oxazolone,OXZ)誘導(dǎo)的兩種不同IBD小鼠模型進(jìn)行對(duì)比干預(yù)，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)在單個(gè)細(xì)胞水平上探討T.spiralis對(duì)腸炎小鼠(TNBS、OXZ誘導(dǎo))脾臟Th1/Th2表達(dá)的影響。更深一步探討旋毛蟲(chóng)防治IBD的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 旋毛蟲(chóng)的收集與攻蟲(chóng)：消化保種小鼠(本實(shí)驗(yàn)室)的肌肉組織，將獲得的肌幼蟲(chóng)(經(jīng)洗滌、計(jì)數(shù))，經(jīng)口攻擊感染實(shí)驗(yàn)小鼠。

1.2方法

1.2.1造模方法及實(shí)驗(yàn)分組 雌性BALB/c小鼠6～8周齡，體重20～25 g，購(gòu)于長(zhǎng)春生物制品所。TNBS結(jié)腸炎模型的建立，依據(jù)Stallmach等[8]方法。隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)小鼠分為三組，A1為對(duì)照組(50%乙醇)，B1為模型組(TNBS誘導(dǎo)，購(gòu)于Sigma公司)，C1為干預(yù)組(預(yù)先感染T.spiralis后誘導(dǎo)TNBS模型)，保證取材時(shí)每組有6只以上小鼠。OXZ結(jié)腸炎模型的建立，依據(jù)Heller等[9]方法。同樣隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)小鼠分為三組，A2為對(duì)照組(50%乙醇)，B2為模型組(OXZ誘導(dǎo)，購(gòu)于Sigma公司)，C2為干預(yù)組(預(yù)先感染T.spiralis后誘導(dǎo)OXZ模型)，(保證取材時(shí)每組有6只以上小鼠)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，經(jīng)口感染T.spiralis400條/只(C1、C2組)，接種21 d后，分別給予50%乙醇灌腸(A1、A2組)和TNBS造模(2 mg TNBS溶液150 μl直腸灌注)(B1及C1組)，B2及C2組給予OXZ造模(1%OXZ溶液150 μl直腸灌注，在直腸灌注藥液前5 d先予3%OXZ無(wú)水乙醇溶液皮膚致敏)，造模后(TNBS、OXZ)分批處死小鼠(第3、7天)，取材檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.2成功感染旋毛蟲(chóng)的判定 小鼠取材后，取感染旋毛蟲(chóng)組小鼠膈肌，于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)肌肉蟲(chóng)則表明成功感染，并計(jì)算感染率及蟲(chóng)體寄生密度。

1.2.3分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞 處死小鼠，打開(kāi)左側(cè)腹部皮膚，小心分離皮下組織和腹部肌肉暴露出脾臟，提起，剪去周?chē)Y(jié)締組織，將脾臟放入離心管中剪碎，將200目鋼網(wǎng)置于六孔板上，用注射器頭研磨成單個(gè)細(xì)胞，收集于離心管中，1 000 r/min離心10 min，棄掉上清，加入5 ml溶血?jiǎng)┗鞈页恋?，室溫靜置10 min，再1 000 r/min離心10 min，PBS沖洗，調(diào)成濃度為1×106ml-1的細(xì)胞懸液。

1.2.4脾臟淋巴細(xì)胞Th1/Th2表達(dá)水平(流式細(xì)胞儀) 首先收獲細(xì)胞，在脾臟淋巴細(xì)胞中加入刺激劑和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(2.5 μl 50 ng/ml PMA、10 μl 1 μg/ml A23187、10 μl 10 μg/ml BFA)，混勻后，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。之后，加入20 μl FITC標(biāo)記的anti- CD3和20 μl PE/Cy5標(biāo)記的anti- CD8進(jìn)行細(xì)胞表面染色，混勻，室溫暗處孵育15 min，離心500 r/min 5 min，棄上清。隨后進(jìn)行固定和破膜，加入0.5 ml的固定劑室溫暗處孵育15 min，加入PBS，離心500 r/min 5 min，棄上清；加入1 ml 的破膜劑室溫暗處孵育10 min，加PBS洗液，離心500 r/min 5 min，棄上清。最后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，加入熒光素標(biāo)記抗體IFN- γ- PE、IL- 4- PE，混勻，室溫暗處孵育30 min。加洗液，離心500 r/min 5 min，棄上清，加入0.5 ml PBS重懸細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)。經(jīng)488 nm氬離子激光激發(fā)后，在波長(zhǎng)530 nm處，抗CD3+單克隆抗體發(fā)綠色熒光；在波長(zhǎng)670 nm處，抗CD8+單克隆抗體發(fā)深紅色熒光；在波長(zhǎng)570 nm處，IFN- γ單克隆抗體及IL- 4單克隆抗體發(fā)桔黃色熒光。

數(shù)據(jù)分析：用FLOW CHECK標(biāo)準(zhǔn)微球校準(zhǔn)流路和光路，利用標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)償，作好FITC、PE、PE/Cy5之間的熒光補(bǔ)償。以CD3- SSC設(shè)門(mén)，圈定CD3+淋巴細(xì)胞。以CD8、IFN- γ和IL- 4分別建立雙參數(shù)點(diǎn)圖對(duì)圈定的CD3+淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析。得出Th1(CD3+CD8-IFN- γ+)和Th2(CD3+CD8-IL- 4+)的百分比。

2 結(jié)果

2.1成功感染旋毛蟲(chóng)的判定 分批處死小鼠取材后，取感染旋毛蟲(chóng)組小鼠膈肌，于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)肌肉蟲(chóng)則表明成功感染，并計(jì)算感染率及蟲(chóng)體寄生密度。本實(shí)驗(yàn)攻蟲(chóng)組小鼠膈肌中蟲(chóng)體寄生密度1 500～2 000條/g。感染成功率為100%。

2.2T.spiralis對(duì)TNBS誘導(dǎo)IBD小鼠脾臟淋巴細(xì)胞Th1/Th2平衡的影響 與單純?cè)炷＝M相比，預(yù)先感染T.spiralis后造模第3天及第7天CD3+CD8-IFN- γ+的Th1細(xì)胞百分比未見(jiàn)明顯變化(P>0.05)，CD3+CD8-IL- 4+的Th2細(xì)胞百分比在造模后第3天也無(wú)差異(P>0.05)，第7天CD3+CD8-IL- 4+的Th2細(xì)胞百分比高于模型組(P<0.05)。與模型組相比，T.spiralis感染小鼠后造模第3天Th1/Th2比值未見(jiàn)明顯下降(P>0.05)，第7天Th1/Th2比值明顯下降(P<0.05)。見(jiàn)圖1、2，表1、2 。

2.3T.spiralis對(duì)OXZ誘導(dǎo)IBD小鼠脾臟淋巴細(xì)胞Th1/Th2平衡的影響 與單純?cè)炷＝M相比，預(yù)先感染T.spiralis后造模第3天及第7天小鼠脾臟CD3+CD8-IFN- γ+的Th1細(xì)胞百分比明顯升高(P<0.05)，CD3+CD8-IL- 4+的Th2細(xì)胞百分比未見(jiàn)明顯變化(P>0.05)，預(yù)先感染T.spiralis小鼠造模后第3天及第7天脾臟Th1/Th2比值與模型組相比均明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3、4，表3、4。

圖1 TNBS造模3 d小鼠脾臟淋巴細(xì)胞百分比Fig.1 Percentage of splenic lymph cells of mouse 3 days after administration of TNBSNote: A. Percentage of splenic CD3+CD8-IFN- γ+lymph cells of mouse 3 days after administration of TNBS；B. Percentage of splenic CD3+CD8-IL- 4+ lymph cells of mouse 3 days after administration of TNBS；C. Percentage of splenic CD3+CD8-IFN- γ+ lymph cells of T. spiralis- infected mouse 3 days after administration of TNBS；D. Percentage of splenic CD3+CD8-IL- 4+ lymph cells of T. spiralis- infected mouse 3 days after administration of TNBS.

圖2 TNBS造模7 d小鼠脾臟淋巴細(xì)胞百分比Fig.2 Percentage of splenic lymph cells of mouse 7 days after administration of TNBSNote: A.Percentage of splenic CD3+CD8-IFN- γ+lymph cells of mouse 7 days after administration of TNBS；B.Percentage of splenic CD3+CD8-IL- 4+ lymph cells of mouse 7 days after administration of TNBS；C.Percentage of splenic CD3+CD8-IFN- γ+ lymph cells of T.spiralis- infected mouse 7 days after administration of TNBS；D.Percentage of splenic CD3+CD8-IL- 4+ lymph cells of T.spiralis- infected mouse 7 days after administration of TNBS.

GroupsCD3+CD8-IFN-γ+(Th1,%)CD3+CD8-IL-4+(Th2,%)Th1/Th250%Ethanol5.21±1.391.40±0.764.07±1.43TNBS8.72±2.461)1.48±0.405.90±1.121)T.spiralis+TNBS7.96±1.571)1.72±0.745.83±4.181)

Note：Vs 50% Ethanol group,1)P<0.05.

GroupsCD3+CD8-IFN-γ+(Th1,%)CD3+CD8-IL-4+(Th2,%)Th1/Th250%Ethanol3.01±0.651.73±0.382.49±1.54TNBS4.89±1.592)0.98±0.455.89±2.292)T.spiralis+TNBS3.80±0.902.11±0.911)2.89±2.671)

Note：Vs TNBS group,1)P<0.05；vs 50% Ethanol group,2)P<0.05.

圖3 OXZ造模3 d小鼠脾臟淋巴細(xì)胞百分比Fig.3 Percentage of splenic lymph cells of mouse 3 days after administration of OXZNote: A.Percentage of splenic CD3+CD8-IFN- γ+lymph cells of mouse 3 days after administration of OXZ；B.Percentage of splenic CD3+CD8-IL- 4+ lymph cells of mouse 3 days after administration of OXZ；C.Percentage of splenic CD3+CD8-IFN- γ+ lymph cells of T.spiralis- infected mouse 3 days after administration of OXZ；D.Percentage of splenic CD3+CD8-IL- 4+ lymph cells of T.spiralis- infected mouse 3 days after administration of OXZ.

圖4 OXZ造模7 d小鼠脾臟淋巴細(xì)胞百分比Fig.4 Percentage of splenic lymph cells of mouse 7 days after administration of OXZNote: A.Percentage of splenic CD3+CD8-IFN- γ+lymph cells of mouse 7 days after administration of OXZ.；B.Percentage of splenic CD3+CD8-IL- 4+ lymph cells of mouse 7 days after administration of OXZ；C.Percentage of splenic CD3+CD8-IFN- γ+ lymph cells of T.spiralis- infected mouse 7 days after administration of OXZ；D.Percentage of splenic CD3+CD8-IL- 4+ lymph cells of T.spiralis- infected mouse 7 days after administration of OXZ.

GroupsCD3+CD8-IFN-γ+(Th1,%)CD3+CD8-IL-4+(Th2,%)Th1/Th250%Ethanol5.21±1.391.40±0.764.07±1.43OXZ3.60±1.122)3.74±0.812)0.79±0.522)T.spiralis+OXZ8.45±1.851)2)3.61±0.692)2.98±0.781)2)

Note：Vs OXZ group,1)P<0.05；vs 50% Ethanol group,2)P<0.05.

Tab.4RatiosofTh1lymphcellscomparedtoTh2lymphcellson7daysafteradministrationofOXZ(n=6,

GroupsCD3+CD8-IFN-γ+(Th1,%)CD3+CD8-IL-4+(Th2,%)Th1/Th250%Ethanol3.01±0.651.73±0.382.01±0.84OXZ3.35±1.052.85±0.872)1.14±0.672)T.spiralis+OXZ8.54±1.631)2)2.51±0.793.32±1.561)2)

Note：Vs OXZ group,1)P<0.05；vs 50% Ethanol group,2)P<0.05.

3 討論

旋毛蟲(chóng)屬于蠕蟲(chóng)中的線蟲(chóng)，是一種人獸共患的寄生蟲(chóng)，肌幼蟲(chóng)經(jīng)口進(jìn)入人體腸道后，感染性肌幼蟲(chóng)6 h即侵入宿主腸黏膜，寄生于多細(xì)胞內(nèi)龕，由一排柱狀上皮細(xì)胞組成，完成蛻皮僅需要30 h，之后發(fā)育為成蟲(chóng)，性成熟的雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)立即進(jìn)行交配，產(chǎn)生的新生幼蟲(chóng)(在感染后第4～5天開(kāi)始)經(jīng)腸黏膜淋巴管或小靜脈，在宿主全身各組織器官進(jìn)行移行。約35 d左右完全定植在肌肉，成為感染性肌幼蟲(chóng)。散在地分布于全球，以溫、熱帶地區(qū)為主，在蠕蟲(chóng)中是產(chǎn)生免疫抑制作用最強(qiáng)的寄生蟲(chóng)之一，宿主感染旋毛蟲(chóng)后產(chǎn)生以Th2型為主的免疫反應(yīng)[10,11]。

因T.spiralis的作用部位直接起源于腸道，最終定植于肌肉，因此，腸道局部乃至全身的免疫反應(yīng)都與旋毛蟲(chóng)分泌的許多天然的有益抗原物質(zhì)關(guān)系密切。

寄生蟲(chóng)對(duì)IBD的中樞免疫細(xì)胞T細(xì)胞有哪些影響呢？

許多研究表明，以Th1為主的免疫應(yīng)答過(guò)度反應(yīng)常常發(fā)生在大多數(shù)IBD模型動(dòng)物中，尤其在TNBS模型的免疫反應(yīng)中占主導(dǎo)作用[12]，類(lèi)似于人類(lèi)CD[13]。OXZ誘導(dǎo)的腸炎模型往往具有UC的病理特征[14]，主要由Th2型細(xì)胞介導(dǎo)。Th1和Th2在介導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中扮演著不同的角色，于分化和功能上相互制約，維持機(jī)體免疫平衡。兩個(gè)亞群的劃分基于CD4+T細(xì)胞分泌的不同細(xì)胞因子和介導(dǎo)的免疫功能，如IFN- γ、IL- 12、TNF- α等細(xì)胞因子的表達(dá)及其功能多代表Th1細(xì)胞亞群，IL- 4和IL- 5、IL- 13的表達(dá)多代表Th2細(xì)胞亞群[15]。任一種細(xì)胞亞群的過(guò)度免疫反應(yīng)都會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的疾病。正因此，TNBS模型和OXZ模型基線Th1/Th2反應(yīng)有明顯差異。另外，具有優(yōu)勢(shì)調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞還包括Th3、Tr1細(xì)胞亞型，它們分別產(chǎn)生的TGF- β和IL- 10，都能抑制Th1和 Th2炎癥免疫反應(yīng)。

我們的前期研究表明[7]，小鼠感染T.spiralis后更易耐受化學(xué)誘導(dǎo)劑TNBS對(duì)結(jié)腸的損傷，T.spiralis主要是抑制了結(jié)腸炎小鼠Th1型過(guò)度免疫反應(yīng)使Th1/Th2達(dá)到平衡，從分子和蛋白水平我們了解其干預(yù)作用可能是通過(guò)誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)及Tr1型細(xì)胞因子而實(shí)現(xiàn)的。相比之下，感染T.spiralis未對(duì)小鼠在OXZ造模時(shí)起到保護(hù)作用，仍然出現(xiàn)了結(jié)腸損傷，但沒(méi)有按預(yù)想的加重腸炎，也就是說(shuō)，基于Th1和Th2相互制約的理論，感染T.spiralis所產(chǎn)生的Th2型免疫反應(yīng)可能會(huì)對(duì)OXZ誘導(dǎo)的Th2型炎癥反應(yīng)起疊加作用而加重病情[16]。

本實(shí)驗(yàn)在原有研究基礎(chǔ)上，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)，刺激脾臟淋巴細(xì)胞后行熒光染色，在單個(gè)細(xì)胞水平上動(dòng)態(tài)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)因子和表面抗原的表達(dá)，更進(jìn)一步對(duì)比研究了T.spiralis對(duì)兩種腸炎小鼠(TNBS、OXZ誘導(dǎo))Th1/Th2偏移的影響。結(jié)果顯示，與TNBS模型組相比，預(yù)先感染T.spiralis的小鼠在誘導(dǎo)TNBS腸炎第7天Th1/Th2比值明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與OXZ模型組相比，預(yù)先感染T.spiralis的小鼠在誘導(dǎo)OXZ腸炎第3、7天Th1/Th2比值均明顯上調(diào)，出現(xiàn)新的偏移，而并非是按理論所設(shè)想的T.spiralis增加了OXZ模型原有的Th2為主的免疫反應(yīng)。經(jīng)研究分析，可能是針對(duì)OXZ腸炎模型T.spiralis誘生出過(guò)量的IL- 10。曾有研究人員指出，由于過(guò)高濃度的IL- 10反而會(huì)激發(fā)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN- γ，從而使IL- 10的抗炎作用受到抑制，因此靜脈應(yīng)用大劑量IL- 10時(shí)反而降低了其抗炎效果[17]。正是Th1/Th2比值的上調(diào)，提示我們，感染T.spiralis使OXZ腸炎小鼠Th1/Th2出現(xiàn)了新的偏移，弱化了Th2表達(dá)，因此不足以加重腸道炎癥。通過(guò)FCM，我們從細(xì)胞水平驗(yàn)證了既往的研究結(jié)論，為T(mén).spiralis干預(yù)IBD的后續(xù)研究提供了更詳實(shí)的理論依據(jù)。對(duì)今后進(jìn)行提取有效抗原蛋白和無(wú)害旋毛蟲(chóng)防治IBD的研究奠定堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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