楊曉靜 孟 瑋 徐宏俊 周向昭

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院皮膚科,張家口 075000)

黑色素瘤也稱為惡性黑色素瘤，是一種從黑色素細胞發(fā)展而來的癌癥[1]。黑色素瘤常見于15～45歲的中青年人，通常發(fā)生于皮膚，但偶爾也會出現(xiàn)在口腔、腸道或眼睛[2]。盡管黑色素瘤僅占皮膚惡性腫瘤中4%，但皮膚癌中80%的死亡卻是由其所造成[3]。黑色素瘤的主要特征是病情進展迅速，而且現(xiàn)有的治療效果不理想，患者很快就出現(xiàn)局部淋巴結(jié)或者遠處器官的轉(zhuǎn)移[4]。因此，進一步深入探尋黑色素瘤的發(fā)病機制，尋找新的分子靶點顯得尤為重要。

最近，越來越多的人注意到一類稱為長鏈非編碼RNA(lncRNA)的基因產(chǎn)物，它在多種腫瘤的發(fā)病和發(fā)展中起到重要的作用[5]。lncRNA的長度一般大于200個核苷酸，可在不同生物行為過程中調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后的表達[6]。有證據(jù)表明，lncRNA參與了細胞的凋亡和侵襲，能重塑干細胞的多功能性，調(diào)節(jié)選擇性剪接、染色質(zhì)重塑和RNA的代謝等[7]。例如，lncRNA HOTAIR能通過增強PRC2調(diào)節(jié)腫瘤侵襲性，抑制腫瘤的遷徙[8]。而lncRNA H19的高表達與胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9]。 PRNCR1和PCGEM1可以調(diào)節(jié)前列腺癌患者體內(nèi)雄激素受體的轉(zhuǎn)錄和表達[10]。

BRAF基因激活的非編碼RNA(BRAF- activated non- coding RNA，BANCR)是位于9號染色體上一個693 bp的 lncRNA，在多種癌癥中有異常的表達，如結(jié)腸直腸癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、甲狀腺乳頭狀癌、肺癌、胃癌和肝細胞癌等[11- 16]。

我們期望通過研究BANCR在黑色素瘤患者中的表達水平，探究BANCR對黑色素瘤細胞侵襲和遷移能力的影響及其調(diào)控機制，挖掘新的分子標記物，為黑色素瘤的診治提供新的方向。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織樣品采集 收集從2007年1月到2011年1月之間在我院進行的黑色素瘤切除手術(shù)的腫瘤組織109例，正常皮膚組織30例。黑色素瘤患者男性58例，女性51例，年齡40～76歲，中位年齡61歲。本研究通過醫(yī)院的醫(yī)學(xué)倫理委員會的同意。黑色素瘤組織經(jīng)過了醫(yī)院病理科組織病理學(xué)的證實。切除的腫瘤組織樣本立即放入液氮中冷凍并儲存在-80℃直至RNA提取。

1.1.2細胞株和實驗試劑 黑色素瘤細胞系A(chǔ)101D、A375、B16均購于武漢大學(xué)細胞典藏中心。RPMI1640培養(yǎng)液、10%新生小牛血清(FBS)、含100 μg/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素的、0.25%胰酶溶液購自Gibco公司,二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司。細胞在含有10%FBS、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長至80%左右濃度時進行傳代和凍存，用于后續(xù)的實驗。細胞培養(yǎng)瓶和96孔板購自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2方法

1.2.1生存分析 使用Kaplan- Meier生存曲線與Log- rank檢驗對黑色素瘤患者進行生存分析。所有治療結(jié)束后，對患者生存預(yù)后情況進行定期隨訪(門診隨訪或電話隨訪邀請患者定期來院復(fù)查)，隨訪截止時間為2017年3月。生存時間(Suivival time)作為計算患者腫瘤相關(guān)生存情況的指標，其定義為從患者初始治療至患者死亡的時間。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染 實驗使用siRNA轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)BANCR在細胞中的低表達。BANCR siRNA購于上海Genepharma公司，靶序列如下siRNA59- CGGAAATAGACTGCAGCACCAA- 39。并根據(jù)制造商的說明書使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsb- ad，CA)將其轉(zhuǎn)染入細胞48 h，獲得相應(yīng)穩(wěn)定表達的細胞株。

1.2.3mRNA提取和qPCR試驗 吉瑪基因有限公司設(shè)計BANCR引物，forward:ACAGGACTCCATGGCAAACG,reverse:ATGAAGAAAGCCTGGTGCAGT;GAPDH:forward:ACCACAGTCCATGCCATCAC,reve- rse:TCCACCACCCTGTTGCTGTA。EP管中加入700 μl 的lysis buffer。細胞直接收集好后加入其中裂解。Trozel(Gibco)抽提組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴增BANCR，用GAPDH作為內(nèi)參物。反應(yīng)條件：以100 ng總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)條件為：37℃ 15 min，95℃ 5 min。后根據(jù)Kapa PCR試劑盒說明書進行PCR反應(yīng)。獲得數(shù)據(jù)以RQ=2-ΔΔCT計算mRNA表達量。實驗重復(fù)3次。

1.2.4Western blot檢測蛋白水平 實驗分為兩組:NC組和BANCR- siRNA組，NC組是未做處理的黑色素瘤A375細胞株，BANCR- siRNA是轉(zhuǎn)染慢病毒后的A375細胞株。按照說明書配制10%SDS- PAGE分離膠，每孔加入20 μg蛋白樣品。使用濕轉(zhuǎn)法將蛋白至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，TBST充分沖洗后，使用1∶1 000稀釋一抗孵育(兔單克隆β- catenin和c- myc抗體)，4℃過夜；加入辣根過氧化酶物標記羊抗兔IgG(1∶2 500)稀釋，室溫孵育2 h；ECL發(fā)光。實驗重復(fù)3次。

1.2.5劃痕愈合實驗檢測黑素瘤細胞的遷移能力 將兩組細胞接種于6孔板，待細胞融合度生長在90%時，用200 μl消毒槍頭垂直劃線，并在顯微鏡下測量劃痕的初始距離(0 time)，在恒溫孵箱中孵育72 h后，測量劃痕的距離，并計算細胞的遷移率。細胞遷移率=[D(t=24 h，48 h)-D(t=0 h)]/D(t=0 h)。實驗重復(fù)3次。

1.2.6Transwell侵襲實驗檢測黑素瘤細胞的侵襲能力 所有試劑及器材均于冰塊上預(yù)冷處理，將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，將Transwell小室內(nèi)膜均勻涂抹Matrigel膠100 μl，37℃孵育20 min，逐步消化、離心、計數(shù)細胞后，按照2.5×104ml-1用無血清培養(yǎng)基將兩組細胞稀釋，制成細胞懸液；按照每孔200 μl的細胞懸液加入Transwell上室，同時在Transwell下室加入10%FBS+培養(yǎng)基500 μl，放入37℃孵箱培養(yǎng)；孵育24 h后使用甲醛固定細胞，結(jié)晶紫染色15 min，使用棉簽去除小室內(nèi)膜上的細胞，然后于顯微鏡下計數(shù)，觀察4個高倍視野(×40)下穿過濾膜的細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1BANCR在黑色素瘤組織和細胞株中的表達 使用qPCR檢測BANCR在組織標本中和黑色素瘤細胞株中的表達情況。如圖1A所示，BANCR在黑色素瘤組織中的mRNA的相對表達量顯著高于正常的皮膚組織(3.10±0.44，P<0.05)。如圖1B所示，在黑色素瘤細胞株A101D、A375、B16中，BANCR的表達均高于正常對照(P<0.05)，而A375細胞的表達最高(3.23±0.14)，且?guī)追N黑色素瘤的生長速度、侵襲及遷移能力相差不明顯，所以我們選擇A375細胞進行下一步功能學(xué)實驗。

2.2BANCR與黑色素瘤患者臨床病理特征之間的關(guān)系 將109例黑色素瘤腫瘤組織樣本和癌旁正常組織進行臨床病理參數(shù)的統(tǒng)計分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(如表1所示)，BANCR在不同年齡性別的黑色素瘤患者之間的表達差異不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。BANCR的表達與黑色素瘤的病理分期及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，病理分期越高，BANCR在黑色素瘤組織中表達也就越高(P<0.05)，而在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中BANCR的表達也明顯高于未轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)。

2.3BANCR與黑色素瘤患者生存時間的關(guān)系 為了探究BANCR對于黑色素瘤患者的預(yù)后價值，使用Kaplan- Meier生存曲線與Log- rank檢驗分析不同BANCR水平的生存時間差異。如圖2所示，BANCR高表達黑色素瘤患者的總生存期顯著低于BANCR低表達者(P<0.01)。BANCR的表達與黑色素瘤患者的生存時間呈負相關(guān)。

圖1 BANCR在組織標本和黑色素瘤細胞株中的表達Fig.1 Expression of BANCR in different tissues and melanoma cell linesNote: *.P<0.05.

表1BANCR的表達與黑色素瘤患者臨床病理特征之間的關(guān)系

Tab.1RelationshipbetweenexpressionofBANCRandclinicopathologicalfeaturesofmelanomapatients

ClinicopathologicaldataNumberHighexpressionofBANCRLowexpressionofBANCRχ2valuePvalueGender1.5720.210Male583226Female512229Age(years)0.0050.944≤6043271660664125Pathologicalstaging10.4580.015Ⅰ1275Ⅱ211011Ⅲ594613Ⅳ17152Lymphnodemetastasis11.4500.001No351817Yes746113

圖2 BANCR與黑色素瘤患者生存時間的關(guān)系Fig.2 Relationship between survival time of BANCR and melanoma patients

圖3 BANCR對A375細胞侵襲能力的影響Fig.3 Effects of BANCR on invasion ability of A375 cellsNote: *.P<0.05.

2.4BANCR對A375細胞侵襲能力的影響 使用siRNA將A375的BANCR進行下調(diào)。Transwell實驗結(jié)果如圖3所示，BANCR- siRNA組通過Matrigel基質(zhì)膠的細胞數(shù)量為(98.54±5.21)，明顯少于對照組(423.34±10.72)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果說明抑制BANCR的表達可以減弱A375細胞的侵襲能力。

2.5BANCR對A375細胞遷移能力的影響 劃痕愈合實驗結(jié)果如圖4所示，在熒光顯微鏡下觀察測量兩組細胞任意三個部位的劃痕寬度，計算相應(yīng)的遷移率，公式如下：遷移率=[D(t=24 h，48 h)-D(t=0 h)]/D(t=0 h)。結(jié)果表明，BANCR- siRNA組細胞的遷移速率明顯低于對照組，兩組在24 h和 48 h 的遷移率分別為(25.61±7.37)% vs (46.92±9.48)%,P<0.05；(31.25±12.75)% vs (72.19±12.23)%,P<0.05。A375細胞的遷移能力隨BANCR的表達降低而降低。

2.6下調(diào)BANCR后對Wnt/β- catenin信號通路的影響 Western blot結(jié)果顯示(圖5)：與NC組相比，BANCR- siRNA組中β- catenin和c- myc蛋白表達水平明顯下降[(1.25±0.18)vs (2.45±0.09);(1.34±0.23)vs (3.17±0.11),P<0.05]；表明下調(diào)BANCR可以影響Wnt/β- catenin信號通路的表達。

圖4 BANCR對A375細胞遷移能力的影響Fig.4 Effects of BANCR on migration ability of A375 cellsNote: *.P<0.05.

圖5 BANCR對β- catenin和c- myc蛋白表達水平的影響Fig.5 Effect of BANCR on protein expression levels of β- catenin and c- mycNote: *.P<0.05.

3 討論

黑色素瘤的主要原因是紫外線暴露于皮膚色素含量較低的人群，通常白人的發(fā)病率高于其他有色人種[17]，而且黑色素瘤的發(fā)病風(fēng)險隨著年齡的增長而增加，診斷時的平均年齡約為60歲[18]。在全球范圍內(nèi)，2012年新發(fā)的黑色素瘤約有23.2萬人，2015年有310萬患有活動性疾病，導(dǎo)致59 800人死亡[19]。來自歐洲，加拿大和美國的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，過去幾十年黑色素瘤的發(fā)病率持續(xù)增長[20]。新西蘭發(fā)病率最高，每10萬人50例[21]。

對于早期的黑色素瘤，活檢確診后，通常進行廣泛的腫瘤切除[22]。除此之外，還可以根據(jù)患者的病理分期，選擇性地采取前哨淋巴結(jié)活檢[23]。而對于晚期黑色素瘤的治療則是從多學(xué)科的方法進行的。近年來隨著靶向治療的發(fā)展，黑色素瘤患者的生存預(yù)后有著顯著的改善[24]。特別是免疫療法已經(jīng)成為除了手術(shù)，化療和放射治療之外，治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的主要方式[25]。2011年6月，一項由ipilimu- mab與達卡巴嗪聯(lián)合治療晚期黑色素瘤的臨床試驗表明，患者的中位生存期從9個月增加到11個月[26]。盡管生存時間有所改善，但與我們預(yù)期的仍有一定距離。所以對于黑色素瘤患者，特別是晚期的患者，我們?nèi)孕枰^續(xù)尋找更高效的治療靶點。

BANCR最早是由Nicola和Ross通過RNA- seq對致癌基因BRAFV600E表達影響的轉(zhuǎn)錄物進行篩選而首次被發(fā)現(xiàn)[27]。Guo等[11]研究表明顯示，BAN CR在結(jié)腸直腸癌中高度表達，BANCR表達增加與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外，BANCR通過MEK/ERK途徑誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來促進子宮內(nèi)膜癌的遷移[28]。而在胃癌中，BANCR通過滅活P38和JNK MAPK促進癌細胞的增殖和遷移，而高BANCR水平與臨床分期，腫瘤深度，淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移、預(yù)后呈正相關(guān)[15]。BANCR表達增加還是視網(wǎng)膜母細胞瘤患者預(yù)后差的獨立危險因素，BANCR的下調(diào)顯著抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞增殖、遷移和體外侵襲[12]。我們的結(jié)果也證實，BANCR與黑色素瘤的遷移能力和侵襲能力密切相關(guān)。而且BANCR的表達與黑色素瘤患者的臨床病理特征也存在一定聯(lián)系，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較高的病理分期往往都存在有高表達的BANCR?；颊叩纳鏁r間也隨BANCR的升高而降低。

Wnt信號通路對黑色素細胞的發(fā)育至關(guān)重要，它可以指導(dǎo)黑色素細胞遷移到表皮和毛囊，并促進其分化，有助于皮膚毛發(fā)的色素形成[29]。而Wnt信號通路蛋白過量表達會導(dǎo)致黑色素細胞數(shù)量的增加。相反，Wnt- 1和Wnt- 3a基因的缺失會導(dǎo)致Wnt信號活性的喪失，從而導(dǎo)致黑色素細胞的減少[30]。

蛋白質(zhì)Wnt家族可以通過三個關(guān)鍵介質(zhì)介導(dǎo)的三種不同途徑發(fā)出信號：β- 連環(huán)蛋白(典型的Wnt信號通路)，JNK(平面細胞極性通路)和PKC /Ca2+(非典型的Wnt信號通路)[31]。事實上越來越多的證據(jù)表明，黑色素瘤中Wnt調(diào)節(jié)的二分體表型歸因于由不同Wnt家族成員刺激的典型和非典型軸之間的相互作用[32]。按照目前的理解是，黑色素瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)化是通過典型的Wnt信號通路，而轉(zhuǎn)移則通過非典型Wnt信號通路[33]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)下調(diào)BANCR后，對Wnt/β- catenin信號通路起到一定的抑制作用，下游的β- catenin和c- myc表達明顯降低。

綜上所述，長鏈非編碼BANCR在黑色素瘤患者中普遍存在高表達，而且與患者生存時間呈負相關(guān)，同時它也能通過激活Wnt/β- catenin信號通路調(diào)控黑色素瘤細胞遷移和侵襲行為。

[1] Simon S,Vignard V,Varey E，etal.Emergence of high- avidity melan- a- specific clonotypes as a reflection of anti- PD- 1 clinical efficacy[J].Cancer Res,2017,77(24):7083- 7093.

[2] Bernatchez C,Cooper ZA,Wargo JA,etal.Novel treatments in development for Melanoma[M].Melanoma.Springer International Publishing,2016:371- 416.

[3] Gamba CS,Clarke CA,Keegan THM,etal.Melanoma survival disadvantage in young,non- Hispanic white males compared with females[J].JAMA Dermatology,2013,149(8):912- 920.

[4] Damsky WE,Theodosakis N,Bosenberg M.Melanoma metastasis:new concepts and evolving paradigms[J].Oncogene,2014,33(19):2413.

[5] Necsulea A,Soumillon M,Warnefors M,etal.The evolution of lncRNA repertoires and expression patterns in tetrapods[J].Nature,2014,505(7485):635.

[6] Yang G,Lu X,Yuan L.LncRNA:a link between RNA and cancer[J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Gene Regulatory Mechanisms,2014,1839(11):1097- 1109.

[7] Engreitz JM,Haines JE,Perez EM,etal.Local regulation of gene expression by lncRNA promoters,transcription and splicing[J].Nature,2016,539(7629):452- 455.

[8] Li L,Dang Q,Xie H,etal.Correction:Infiltrating mast cells enhance prostate cancer invasion via altering LncRNA- HOTAIR/PRC2- androgen receptor (AR)- MMP9 signals and increased stem/progenitor cell population[J].Oncotarget,2016,7(50):83828.

[9] Li H,Yu B,Li J,etal.Overexpression of lncRNA H19 enhances carcinogenesis and metastasis of gastric cancer[J].Oncotarget,2014,5(8):2318.

[10] Prensner JR,Sahu A,Iyer MK,etal.The lncRNAs PCGEM1 and PRNCR1 are not implicated in castration resistant prostate cancer[J].Oncotarget,2014,5(6):1434.

[11] Guo Q,Zhao YAN,Chen J,etal.BRAF activated long non coding RNA contributes to colorectal cancer migration by inducing epithelial mesenchymal transition[J].Oncol Letters,2014,8(2):869- 875.

[12] Su S,Gao J,Wang T,etal.Long non- coding RNA BANCR regulates growth and metastasis and is associated with poor prognosis in retinoblastoma[J].Tumor Biol,2015,36(9):7205- 7211.

[13] Wang Y,Guo Q,Zhao YAN,etal.BRAF activated long non coding RNA contributes to cell proliferation and activates autophagy in papillary thyroid carcinoma[J].Oncol Letters,2014,8(5):1947- 1952.

[14] Sun M,Liu XH,Wang KM,etal.Downregulation of BRAF activated non- coding RNA is associated with poor prognosis for non- small cell lung cancer and promotes metastasis by affecting epithelial- mesenchymal transition[J].Mole Cancer,2014,13(1):68.

[15] Li L,Zhang L,Zhang Y,etal.Increased expression of LncRNA BANCR is associated with clinical progression and poor prognosis in gastric cancer[J].Biomed Pharmacoth,2015,72:109- 112.

[16] Zhou T,Gao Y.Increased expression of LncRNA BANCR and its prognostic significance in human hepatocellular carcinoma[J].World J Sur Oncol,2016,14(1):8.

[17] Nikolaou V,Stratigos AJ.Emerging trends in the epidemiology of melanoma[J].Br J Dermatol,2014,170(1):11- 19.

[18] 王亞麗,石光躍,龔海燕,等.333 例惡性黑色素瘤患者的預(yù)后相關(guān)因素分析[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2014,22(2):444- 447.

Wang YL,Shi GY,Gong HY,etal.Prognosis factor of 333 cases of malignant melanoma[J].J Modern Oncol,2014,22(2):444- 447.

[19] 楊鎵寧,鄧 菲,潘 寧.c- Myc 調(diào)控 PIK3R3 抑制黑色素瘤 B16- F10 細胞的遷移和侵襲[J].中國免疫學(xué)雜志,2017,33(1):66.

Yang JN,Deng F,Pan N,etal.c- Myc promoted migration and invasion of malignant melanoma B16-F10 cells through regulating PIK3R3[J].Chin J Immunol,2017,33(1):66.

[20] Arnold M,Holterhues C,Hollestein LM,etal.Trends in incidence and predictions of cutaneous melanoma across Europe up to 2015[J].J Eurol Acad Dermatol Vener,2014,28(9):1170- 1178.

[21] Fong ZV,Tanabe KK.Comparison of melanoma guidelines in the USA,Canada,Europe,Australia and New Zealand:a critical appraisal and comprehensive review[J].Bri J Dermat,2014,170(1):20- 30.

[22] Pasquali S,Sommariva A,Spillane AJ,etal.Measuring the quality of melanoma surgery- highlighting issues with standardization and quality assurance of care in surgical oncology[J].Euro J Sur Oncol(EJSO),2017,43(3):561- 571.

[23] Leiter U,Stadler R,Mauch C,etal.Complete lymph node dissection versus no dissection in patients with sentinel lymph node biopsy positive melanoma (DeCOG- SLT):a multicentre,randomised,phase 3 trial[J].Lancet Oncol,2016,17(6):757- 767.

[24] 楊鎵寧,鄧 菲,潘 寧.多酚氧化酶抑制劑高良姜素抗黑色素瘤機制研究[J].中國免疫學(xué)雜志,2017,33(7):1000.

Yang JN, Deng F,Pan N,etal.Inhibitory effect of galangin on polyphenol oxidase and study of mechanism[J].Chin J Immunol,2017,33(7):1000.

[25] Hu Z,Xia J,Fan W,etal.Human melanoma immunotherapy using tumor antigen- specific T cells generated in humanized mice[J].Oncotarget,2016,7(6):6448.

[26] Robert C,Thomas L,Bondarenko I,etal.Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma[J].New Engl J Med,2011,364(26):2517- 2526.

[27] McCarthy N.Going places with BANCR[J].Nat Rev Cancer,2012,12(7)：451.

[28] Wang D,Wang D,Wang N,etal.Long non- coding RNA BANCR promotes endometrial cancer cell proliferation and invasion by regulating MMP2 and MMP1 via ERK/MAPK signaling pathway[J].Cell Physi Biochem,2016,40(3- 4):644- 656.

[29] Brown K,Yang P,Salvador D,etal.WNT/beta- catenin signaling regulates mitochondrial activity to alter the oncogenic potential of melanoma in a PTEN- dependent manner[J].Oncogene,2017,36(22):3119.

[30] Chien AJ,Haydu LE,Biechele TL,etal.Targeted BRAF inhibition impacts survival in melanoma patients with high levels of Wnt/β- catenin signaling[J].PLoS One,2014,9(4):e94748.

[31] Anastas JN,Moon RT.WNT signalling pathways as therapeutic targets in cancer[J].Nat Rev Cancer,2013,13(1):11.

[32] Xue G,Romano E,Massi D,etal.Wnt/β- catenin signaling in melanoma:Preclinical rationale and novel therapeutic insights[J].Cancer Treatment Revi,2016,49:1- 12.

[33] Kovacs D,Migliano E,Muscardin L,etal.The role of WNT/β- catenin signaling pathway in melanoma epithelial- to- mesenchymal- like switching:evidences from patients- derived cell lines[J].Oncotarget,2016,7(28):43295.