胡明華 鄧向亮 徐 路

(無限極(中國)有限公司，廣州 510600)

研究表明中草藥多糖具有顯著的生物學(xué)活性，其中免疫調(diào)節(jié)作用是報(bào)道較多的生物活性之一[1]。中草藥多糖能從多個(gè)方面調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，包括調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等功能以及細(xì)胞因子、抗體等免疫分子的分泌水平[2- 4]。多糖的生物學(xué)活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子量和糖鏈結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，不同來源的中草藥多糖可能具有不同的免疫調(diào)節(jié)功能，因此由不同藥材來源多糖按一定比例組成的復(fù)合多糖，具有更全面的免疫調(diào)節(jié)作用[5]。本課題組前期研究選用明確具有免疫調(diào)節(jié)作用的來源于香菇、茯苓和銀耳的多糖，按一定比例組成復(fù)合多糖，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合多糖可以恢復(fù)免疫抑制小鼠T/B細(xì)胞比例及細(xì)胞因子IL- 2、IL- 6的分泌水平，結(jié)果表明復(fù)合多糖較單一多糖的作用更明顯，顯示出復(fù)合多糖組分的協(xié)同作用[6]。本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察該復(fù)合多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果將進(jìn)一步豐富香菇茯苓銀耳復(fù)合多糖的免疫調(diào)節(jié)內(nèi)涵，為其開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1主要試劑和儀器 香菇茯苓銀耳復(fù)合多糖溶液(以下簡稱CP)：290 mg CP溶于1 ml 二甲基亞砜(DMSO)，用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer，PBS)定容至29 ml，終濃度為10 mg/ml，0.22 μm微孔濾膜過濾，4℃保存。10 mmol/L抗壞血酸儲(chǔ)備液；500 μg/ml LPS儲(chǔ)備液；一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒購于ThermoFisher公司；小鼠流式CD40抗體，CD80抗體和CD86抗體均購于BioLegend公司；羅丹明B，四氫呋喃(THF)均購于Sigma公司。

Leica，DM5000B生物熒光顯微鏡；湘儀 L535R臺(tái)式大容量冷凍離心機(jī)；BD FACSCantoⅡ型流式細(xì)胞儀；Thermo Multiskan Ascent多功能酶標(biāo)儀；Tghuat- ZD300全自動(dòng)振蕩儀；kq- 5200型超聲波清洗儀。

1.1.2巨噬細(xì)胞 小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞來源于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，用RPMI1640完全培養(yǎng)液(含胎牛血清10%、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml)置于37℃、5%CO2、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)分組：NC組(正常對(duì)照組)；AscA組(抗壞血酸組)；RNP組(納米微球組)；CP組(復(fù)合多糖組)；Pre- CP組(復(fù)合多糖預(yù)處理組)；Co- CP組(復(fù)合多糖同時(shí)處理組)；CP+RNP組(復(fù)合多糖+納米微球組)；LPS組(脂多糖刺激組)；Pre- CP+LPS組(復(fù)合多糖預(yù)處理+脂多糖刺激組)；Co- CP+LPS組(復(fù)合多糖與脂多糖同時(shí)處理組)；AscA+LPS組(抗壞血酸與脂多糖同時(shí)處理組)。

1.2.1納米微球的制備 檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬功能的包被羅丹明B納米微球(Rhodamine B encapsulated organic nanopart- icles，RNP)的制備流程見圖1：①取10 μl羅丹明B的DMSO溶液(20 mmol/L)于1.5 ml EP管中(即0.1 mg羅丹明B)；②稱取0.1 mg磷脂，用0.2 ml 四氫呋喃(THF)將它們?nèi)芙猓瑩u勻至澄清；③混合上述②和②溶液，混勻至澄清，記為A溶液；④在超聲條件下將A溶液迅速加入經(jīng)冰浴15 min的10 ml去離子水中，繼續(xù)超聲1 min；超聲后，置于40℃油浴，在吹氮?dú)鈼l件下持續(xù)攪拌2 h；⑤四氫呋喃(THF)完全清除后，將混合物溶液置于截留分子量為30 kD的旋轉(zhuǎn)過濾器中，3 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，棄濾液，注入去離子水洗滌3次；⑥將制備好的水溶性羅丹明B熒光微球置塑料小瓶中保存。

1.2.2CP對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響 為了考察CP對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響，取RAW264.7接種于96孔板，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)過夜。試驗(yàn)分為短時(shí)毒性試驗(yàn)和長時(shí)毒性試驗(yàn)：①短時(shí)毒性試驗(yàn)：各組細(xì)胞分別加入不同體積的CP溶液，調(diào)整使CP終濃度分別為0、50、100、200、400、800、3 200 μg/ml，培養(yǎng)4 h。②長時(shí)毒性試驗(yàn)：各組細(xì)胞分別加入不同體積的CP溶液，調(diào)整使CP終濃度分別為0、200、250、300、350、400、500、1 000 μg/ml，培養(yǎng)24 h。

細(xì)胞培養(yǎng)完后，每孔加入20 μl新配制的0.5%的溴化噻唑藍(lán)四氮唑(MTT)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔加入150 μl DMSO，用振蕩儀振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm及630 nm吸光度(630 nm為參照)。

1.2.3CP對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力測(cè)定 取處于對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞分組及處理如下：①Pre- CP組：細(xì)胞與500 μg/ml CP分別共孵1、2、4、8、12 h，然后與RNP共孵2 h。②Co- CP組：細(xì)胞與500 μg/ml CP以及RNP分別共孵1、2、4、8、12 h。

圖1 RNP的制作過程示意圖Fig.1 Schematically illustration of preparation of RNP

③AscA組：細(xì)胞與300 nmol/L抗壞血酸以及RNP分別共孵1、2、4、8、12 h。④NC組：細(xì)胞單獨(dú)與RNP分別共孵1、2、4、8、12 h。采用熒光顯微鏡成像和流式細(xì)胞術(shù)(FACS)來測(cè)定被吞噬的熒光微球的熒光強(qiáng)度以定量分析納米球被吞噬情況。

1.2.4CP對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響 RAW264.7細(xì)胞(1×105)接種到24孔板，與不同濃度的CP共培養(yǎng)12 h和24 h。孵育結(jié)束后，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)基(110 μl)并離心。在96孔板中分別加培養(yǎng)基上清液(100 μl)、去離子水(180 μl)和Griess試劑(20 μl)，然后將混合物在室溫下溫育30 min 并在紫外- 可見分光光度計(jì)548 nm處分析，吸光度值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相對(duì)應(yīng)的NO的含量。

1.2.5CP對(duì)RAW264.7細(xì)胞CD40、CD80和CD86分子表達(dá)的影響 RAW264.7細(xì)胞(8×105)接種到6孔板，貼壁過夜，加入CP(500 μg/ml)孵育12 h和24 h。孵育結(jié)束后加入冷PBS，收集細(xì)胞并用4%多聚甲醛固定細(xì)胞。APC標(biāo)記的CD40抗體、FITC標(biāo)記的CD80抗體和PE標(biāo)記的CD86抗體均加入到100 μl的細(xì)胞中，室溫下溫育1 h，細(xì)胞用PBS洗3遍，上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)并記錄的細(xì)胞數(shù)設(shè)定為 5 000個(gè)。

1.2.6CP對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化的影響 為了考察CP對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化的影響，本研究按以下四種方案處理RAW264.7細(xì)胞：①LPS組(陰性對(duì)照)：RAW264.7細(xì)胞與100 ng/ml LPS共孵。②Pre- CP+LPS組：RAW264.7細(xì)胞先與濃度為100、200、300、400、500、750、1 000 ng/ml的CP共孵24 h。棄上清，加入濃度為100 ng/ml LPS共孵。③Co- CP+LPS組：RAW264.7細(xì)胞與濃度為100、200、300、400、500、750、1 000 ng/ml的CP及濃度為100 ng/ml LPS共孵。④AscA+LPS組(陽性對(duì)照)：RAW264.7細(xì)胞與濃度為0、100、400、500 nmol/L的抗壞血酸方及濃度為100 ng/ml LPS共孵。細(xì)胞經(jīng)上述處理一定時(shí)間后，收集細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD40、CD80和CD86分子表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1CP對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響 短時(shí)毒性試驗(yàn)中，CP對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力沒有顯著影響，即使CP濃度高達(dá)3 200 μg/ml，4 h的共孵也未減弱或增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的活力(圖2A)。與之相對(duì)的，在長時(shí)毒性試驗(yàn)中，濃度低于500 μg/ml的CP對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力無影響；而當(dāng)CP的濃度達(dá)到1 000 μg/ml時(shí)，RAW264.7細(xì)胞活力有輕微的減弱(圖2B)。

2.2CP對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬的影響 通過熒光顯微鏡可以觀察到，CP與RNP共孵育隨時(shí)間增加，CP能明顯增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞對(duì)RNP的吞噬作用(圖3A)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)與正常組相比，12 h與 24 h 兩者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見圖3B。本實(shí)驗(yàn)條件下CP預(yù)處理對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬作用沒有明顯影響。

圖2 CP對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響(n=5)Fig.2 Effect of CP on RAW264.7 cell viability(n=5)Note: A.Short term (4 h)incubation;B.Long term (24 h)incubation.*.P<0.05.

圖3 熒光顯微鏡分析CP對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬作用的影響(n=5)Fig.3 Effect of CP on RAW264.7 cells phagocytosis by Fluorescence microscopy analysis(n=5)Note: A.Representative fluorescence images of cells with uptaken RNP at different incubation time points (1,8,and 24 h)co- treatment with CP product；B.Fluorescence intensity quantification analysis obtained from cell images.CP- Pre.CP pretreatment group;CP- Co.CP co- treatment group;AscA.Ascorbic acid treatment group;NC.Negative control group.*.P<0.05；#.P<0.000 1.

為了驗(yàn)證上述結(jié)果的可靠性，本研究又采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了RAW264.7細(xì)胞對(duì)熒光微球RNP吞噬情況。結(jié)果如圖4所示，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)CP處理4、8、24 h后熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，即吞噬RNP能力增強(qiáng)，與RNP比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示CP的確可以增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的吞噬功能。

2.3CP對(duì)RAW264.7釋放NO的影響 結(jié)果如圖5所示，RAW264.7細(xì)胞釋放NO的量以CP組與陰性對(duì)照的比值表示，即以相對(duì)分泌量表示。CP處理12 h時(shí)，對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌的NO的量幾乎無影響，在給藥濃度為1 000 μg/ml時(shí)，細(xì)胞NO的產(chǎn)生量略微升高(1.21∶1)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。處理24 h后，RAW264.7細(xì)胞釋放NO的量增加了一倍，與陰性對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)分析CP對(duì)RAW264.7細(xì)胞的吞噬作用(n=5)Fig.4 Effect of CP on RAW264.7 cells endocytosis by FACS analysed(n=5)Note: A.Representative flow cytometry images of cells with uptaken RNP at different incubation time points (1,4,8,and 24 h)；B.Fluorescence intensity quantification analysis obtained from flow cytometry detection.ns.Not significant，#.P<0.000 1.

2.4CP對(duì)RAW264.7細(xì)胞CD40、CD80和CD86分子表達(dá)的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞活化標(biāo)志分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)水平，結(jié)果如圖6所示，巨噬細(xì)胞與500 μg/ml的CP共孵12、24 h后，其活化分子標(biāo)記CD40、CD80和CD86表達(dá)增強(qiáng)，而且24 h比12 h的增強(qiáng)更為顯著。

圖5 CP對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO釋放的影響(n=5)Fig.5 Effct of CP on NO production in RAW264.7 cells(n=5)Note: Blank line indicates results for 12 h treatment and red line indicates for 24 h treatment.The NO production without CP treatment at 12 h was regarded as “1” and served as the normalization standard for data obtained from other time points；#.P<0.000 1.

圖6 CP對(duì)RAW264.7細(xì)胞活化的影響(n=5)Fig.6 Effects of CP on RAW264.7 cells activation(n=5)Note: A to C.Markers CD40,CD80,CD86 were detected using FACS analysis；D.Fluorescence intensity quantification analysis obtained from flow cytometry detection.ns.Not significant，**.P<0.01,#.P<0.000 1.

圖7 CP對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化的影響(n=5)Fig.7 Effects of CP on activation in LPS- induced RAW264.7 cells(n=5)Note: A.Representative flow cytometry images of cells with CD molecules at different incubation time points (1,12 and 24 h)；B.Fluorescence intensity quantification analysis obtained from flow cytometry detection.ns.Not significant，**.P<0.01,#.P<0.000 1.

2.5CP對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7活化的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞經(jīng)CP和LPS聯(lián)合處理后的活化標(biāo)志分子CD40、CD80和CD86表達(dá)水平，結(jié)果如圖7所示，共孵1 h后，各藥物處理組細(xì)胞表面CD分子表達(dá)與LPS組比較無明顯變化；共孵12 h后，各藥物處理組細(xì)胞的CD分子明顯低于LPS組；在24 h時(shí)間點(diǎn)，各藥物處理組CD分子的變化更加明顯，Pre- CP+LPS組與Co- CP+LPS組的抑制效果均優(yōu)于AscA+LPS組，結(jié)果提示CP對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞活化具有顯著的抑制作用。

3 討論

巨噬細(xì)胞作為機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞，是機(jī)體免疫防御的第一道防線，同時(shí)在多種免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)由香菇多糖、茯苓多糖和銀耳多糖按一定比例組成的復(fù)合多糖對(duì)免疫抑制小鼠的細(xì)胞免疫功能具有更全面的調(diào)節(jié)作用，然而其對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響尚未清楚。因此本研究考察了該復(fù)合多糖對(duì)不同狀態(tài)下巨噬細(xì)胞功能的影響，以進(jìn)一步加深對(duì)其免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用的認(rèn)識(shí)，并為其開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究首先考察了香菇茯苓銀耳復(fù)合多糖對(duì)靜息狀態(tài)巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞功能的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RAW264.7細(xì)胞與復(fù)合多糖共孵育條件下，復(fù)合多糖可以增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞對(duì)熒光微球的吞噬作用，且隨著時(shí)間的延長愈加明顯；復(fù)合多糖低濃度對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO無影響，當(dāng)濃度達(dá)1 000 μg/ml時(shí)才能促進(jìn)其顯著分泌NO。NO不僅參與巨噬細(xì)胞殺傷腫瘤和胞內(nèi)菌與寄生蟲，而且還參與細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，特別是與炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子。因此，NO的釋放量是觀察免疫細(xì)胞活性的常見指標(biāo)[8,9]。CD40、CD80和CD86是巨噬細(xì)胞活化的標(biāo)志分子，巨噬細(xì)胞受刺激活化后高表達(dá)此類CD分子[10,11]。本研究結(jié)果中，復(fù)合多糖可以提高靜息狀態(tài)巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞CD40、CD80和CD86分子表達(dá)水平，在LPS刺激下則抑制其表達(dá)，起到了有效的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道，香菇多糖、茯苓多糖和銀耳多糖的免疫調(diào)節(jié)作用研究結(jié)果一致[12- 14]。

本研究還考察了香菇茯苓銀耳復(fù)合多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞活化的影響。LPS可以通過TLR4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，并分泌多種炎癥因子，因此是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化的常用刺激劑[15]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS刺激后RAW264.7細(xì)胞CD分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)水平顯著升高。香菇茯苓銀耳復(fù)合多糖在預(yù)孵育和共孵育條件下，都可以抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞活化，即抑制CD40、CD80和CD86分子的表達(dá)，提示該復(fù)合多糖對(duì)活化的巨噬細(xì)胞功能具有抑制作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，中草藥多糖對(duì)巨噬細(xì)胞功能調(diào)節(jié)作用可能是雙向的[16,17]。張俊等[16]研究了板藍(lán)根多糖對(duì)大鼠不同免疫狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根多糖能夠抑制免疫亢進(jìn)組大鼠的亢進(jìn)趨勢(shì)，提升免疫抑制組大鼠的免疫功能，對(duì)環(huán)磷酰胺造模大鼠具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用。江澤波等[17]研究了豬苓多糖對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的雙向免疫調(diào)節(jié)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬苓多糖可以極化巨噬細(xì)胞為M1型，增加由IFN- γ誘導(dǎo)的M1炎癥因子的表達(dá)，增加抑炎因子的表達(dá)，有著雙向的調(diào)節(jié)作用，但是相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜合上述，香菇茯苓銀耳復(fù)合多糖對(duì)不同狀態(tài)下巨噬細(xì)胞功能具有調(diào)節(jié)作用，即可以促進(jìn)靜息狀態(tài)下巨噬細(xì)胞活化和吞噬作用，而對(duì)活化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞功能具有抑制作用。

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