張婧婧 王向鵬 楊曉煜 姬穎華 狄文玉 張清琴 申 威 于海川 路 平

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院和河南省分子診斷與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，新鄉(xiāng) 453003)

肝癌嚴(yán)重威脅著人類的健康，2012年全球范圍內(nèi)就有74.5萬人死于肝癌，就發(fā)病率而言在惡性腫瘤中排名第六，且呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[1,2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non- coding RNA，lncRNA)是一類不具蛋白質(zhì)編碼功能的RNA，長(zhǎng)度大于200 nt。越來越多的報(bào)道顯示大量異常表達(dá)的lncRNAs在癌癥中起著重要作用。Li等[3]發(fā)現(xiàn)胃癌腫瘤組織中存在多種異常表達(dá)的lncRNAs，其中有135種lncRNAs的表達(dá)量是正常組織的2倍以上。在肝癌中，微陣列分析也發(fā)現(xiàn)了許多異常表達(dá)的lncRNAs[4]。且這些lncRNAs與腫瘤發(fā)生、遷移、預(yù)后及診斷等存在著密切聯(lián)系[5,6]。BRAF 基因激活的非編碼 RNA(BRAF- activated non- coding RNA，BANCR)作為lncRNAs的一種，在惡性黑色素瘤、肺癌、胃癌等多種癌癥中都是異常表達(dá)，且與這些癌癥的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)[7]。有研究表明在109例肝細(xì)胞癌組織中，BANCR表達(dá)上調(diào)[8]。但運(yùn)用siRNA干擾BANCR對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2生物學(xué)功能的影響還鮮有報(bào)道。本文將對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2中siRNA干擾BANCR后在細(xì)胞增殖、遷移和血管新生方面的影響進(jìn)行探討，為尋找新的肝癌治療方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株和主要試劑 人肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)自四川大學(xué)華西醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)研究中心衛(wèi)生部移植工程和移植免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，由實(shí)驗(yàn)室保種。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection,ATCC)。培養(yǎng)基DMEM和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Invitrogen英駿公司。Cell Counting Kit- 8 (CCK- 8)購(gòu)自日本同仁化學(xué)公司。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Annexin V Apoptosis Detection Kit和Transwell小室及人工基底膜均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)基為添加了10%胎牛血清和1%青- 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，并置于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞增殖到約80%時(shí)，PBS洗一次，胰酶消化2 min，加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，23℃ 1 500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，立即重懸細(xì)胞，1∶5 傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2CCK- 8檢測(cè)細(xì)胞增殖 BANCR siRNA和Scramble分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染0、1、2、3、4 d后，用CCK- 8試劑盒對(duì)轉(zhuǎn)染BANCR siRNA、Scramble和未轉(zhuǎn)染的三組細(xì)胞的增殖進(jìn)行檢測(cè)。CCK- 8溶液預(yù)先用正常的培養(yǎng)基稀釋到10%，細(xì)胞重懸于上述稀釋液中，于37℃培養(yǎng)1～4 h，450 nm處檢測(cè)吸光值，計(jì)算細(xì)胞增殖倍數(shù)。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染48～72 h后，收集三組細(xì)胞，并重懸于1×Binding buffer中，使細(xì)胞量達(dá)到1×106ml-1。然后利用Annexin V- fluorescein isothiocyanate (FITC)，碘化丙啶(Propidium iodide，PI)染色15 min，利用流式細(xì)胞儀對(duì)染色的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 首先細(xì)胞懸浮于含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中至細(xì)胞密度為1 × 106ml-1，然后將細(xì)胞懸液加入鋪有人工基底膜的Transwell的上室中，在下室中加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24 h后，用0.5%的結(jié)晶紫對(duì)上室底部細(xì)胞進(jìn)行染色，并用棉簽將上室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞除去。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。

1.2.5管腔形成實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞不換液培養(yǎng)的連續(xù)培養(yǎng)3 d的培養(yǎng)基，離心取上清。將上清與培養(yǎng)基等比例混合加入到鋪有Matrigel基質(zhì)膠的孔板中。然后取5 × 105ml-1的HUVEC細(xì)胞加入上述孔板中，共培養(yǎng)72 h后倒置顯微鏡下觀察。

1.2.6免疫印跡分析蛋白質(zhì)的表達(dá) 收集細(xì)胞，PBS洗3次，然后加入已添加PMSF、DTT和蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，后提取總蛋白。等量的蛋白進(jìn)行SDS- PAGE凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜。用5%的BSA進(jìn)行封閉后，依次孵育一抗和二抗，最后進(jìn)行顯色。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS16.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩兩比較采用獨(dú)立的t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CCK- 8檢測(cè)HepG2的細(xì)胞增殖 利用qRT- PCR檢測(cè)人肝癌細(xì)胞HepG2和正常肝細(xì)胞L02中BANCR的表達(dá)，如圖1A所示，BANCR在HepG2中的表達(dá)明顯高于L02(P<0.05)。運(yùn)用BANCR siRNA對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的BANCR進(jìn)行干擾，轉(zhuǎn)染Scramble作為干擾對(duì)照組，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞HepG2作為陰性對(duì)照組，檢測(cè)了HepG2中BANCR的表達(dá)情況。圖1B結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入BANCR siRNA后BANCR的相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)?？梢?，BANCR確實(shí)被沉默了。另外檢測(cè)BANCR siRNA轉(zhuǎn)染不同天數(shù)下，細(xì)胞的增殖倍數(shù)。圖1C的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染BANCR siRNA 3 d以后，HepG2的細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。由此可見，BANCR在HepG2中高表達(dá)，用BANCR siRNA干擾BANCR后，HepG2的細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制。

2.2流式細(xì)胞術(shù)分析HepG2的細(xì)胞凋亡 用Annexin V- FITC和PI對(duì)3組細(xì)胞進(jìn)行雙染后，從圖2A的散點(diǎn)圖可以看出，與對(duì)照組相比，BANCR siRNA干擾BANCR后，HepG2的細(xì)胞凋亡顯著升高了。進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞凋亡率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，圖2B結(jié)果顯示，BANCR siRNA組的細(xì)胞凋亡率明顯增加了，約大于對(duì)照組的2倍(P<0.05)。從這些結(jié)果可以看出，BANCR siRNA干擾HepG2的BANCR后促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。

2.3HepG2細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 運(yùn)用鋪有人工基底膜Matrigel的Transwell小室對(duì)3組細(xì)胞的侵襲能力進(jìn)行分析。結(jié)晶紫染色后顯微鏡觀察，與對(duì)照組相比，BANCR siRNA組穿過Transwell上室的細(xì)胞明顯少于對(duì)照組(圖3A)。為了進(jìn)行定量分析，隨機(jī)選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野下的細(xì)胞數(shù)量。從圖3B的統(tǒng)計(jì)結(jié)果不難看出，BANCR siRNA組平均每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)量明顯低于對(duì)照組，約為對(duì)照組的三分之一(P<0.05)?？梢?，利用siRNA對(duì)HepG2細(xì)胞的BANCR進(jìn)行干擾后，HepG2細(xì)胞的侵襲能力受到了嚴(yán)重影響。

2.4免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲標(biāo)記蛋白的表達(dá) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證BANCR siRNA對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲方面的影響，利用免疫印跡技術(shù)對(duì)細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白PCNA、凋亡標(biāo)記蛋白Caspase- 3和侵襲標(biāo)記蛋白MMP- 9、Fn、Vimentin進(jìn)行了表達(dá)分析，GAPDH作為內(nèi)參。由圖4A的免疫印跡結(jié)果圖可以看出，BANCR siRNA組細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白PCNA和侵襲標(biāo)記蛋白MMP- 9的表達(dá)都明顯低于對(duì)照組；而BANCR siRNA組細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白Caspase- 3的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。進(jìn)一步對(duì)免疫印跡的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白PCNA在BANCR siRNA組的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，約為對(duì)照組的六分之一；細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白Caspase- 3在BANCR siRNA組的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，約為對(duì)照組的六倍；侵襲標(biāo)記蛋白MMP- 9、Fn和Vimentin在BANCR siRNA組的相對(duì)表達(dá)量則低于對(duì)照組(P<0.05，圖4B～F)。綜上所述，BANCR siRNA對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖和侵襲具有抑制作用，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖1 qRT- PCR檢測(cè)BANCR表達(dá)(A、B)和CCK- 8檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖(C)Fig.1 Expression of BANCR was detected by qRT- PCR (A,B) and cell proliferation of HepG2 was tested by CCK- 8 (C)Note: A.The expression of BANCR in hepatocarcinoma cell line HepG2,*.P<0.05 versus normal hepatocyte L02；B.The expression of BANCR in hepatocarcinoma cell line HepG2 transfected with BANCR siRNA；C.Cell proliferation of HepG2 transfected with BANCR siRNA,*.P<0.05 versus HepG2 group.

圖2 流式細(xì)胞分析HepG2細(xì)胞凋亡Fig.2 Cell apoptosis of HepG2 was measured by flow cytometryNote: A.Scatter diagram of flow cytometry；B.Histogram represents the statistical analysis of flow cytometry.*.P<0.05 versus HepG2 group.

圖3 Transwell分析HepG2細(xì)胞侵襲(結(jié)晶紫染色，×100)Fig.3 Invasion of HepG2 was detected by transwell(invasion crystal violet staining，×100)Note: A.Invasion of HepG2 was detected by transwell invasion；B.Histogram represents the statistical analysis of transwell invasion.*.P<0.05 versus HepG2 group.

圖4 免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲標(biāo)記蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of cell proliferation,apoptosis and invasion marker proteins was tested by Western blot Note: A.Expression of PCNA,Caspase- 3,MMP- 9,Fn,Vimentin was measured by Western blot；B-F.Histogram represents the statistical analysis of Western blot.*.P<0.05 versus HepG2 group.

圖5 管腔形成實(shí)驗(yàn)及免疫印跡檢測(cè)血管新生因子的蛋白表達(dá)Fig.5 Tube formation assay and expression of angiogenic factors was measured by Western blotNote: A.Tube formation assay.B.Expression of VEGF，bFGF and IFN- γ was detected by by Western blot；C-E.Histogram represents the statistical analysis of Western blot.*.P<0.05 versus HepG2 group.

2.5管腔形成分析及促血管新生因子血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)以及血管新生抑制因子γ干擾素(IFN- γ)的蛋白表達(dá)分析 利用管腔形成實(shí)驗(yàn)分析BANCR對(duì)血管新生的影響。圖5A顯示，轉(zhuǎn)染BANCR siRNA后，血管新生能力明顯減弱。免疫印跡對(duì)促血管新生相關(guān)因子VEGF、bFGF和IFN- γ的蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，GAPDH作為內(nèi)參。免疫印跡結(jié)果圖顯示，促血管新生因子VEGF和 bFGF在BANCR siRNA組中 的蛋白表達(dá)都明顯低于對(duì)照組，血管新生抑制因子IFN- γ在BANCR siRNA組中 的蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(圖5B)。從圖5C～E的統(tǒng)計(jì)結(jié)果不難看出，BANCR siRNA組VEGF的相對(duì)表達(dá)量約為對(duì)照組的三分之一；bFGF的相對(duì)表達(dá)量約為對(duì)照組的一半；IFN- γ的相對(duì)表達(dá)量約為對(duì)照組的兩倍(P<0.05)。由此可見，siRNA干擾BANCR后會(huì)抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的促血管新生因子VEGF、bFGF表達(dá)，促進(jìn)血管新生抑制因子IFN- γ的蛋白表達(dá)而影響血管新生。

3 討論

中國(guó)的肝癌病例約占全世界的50%，目前較為普遍的治療方法包括外科切除、肝臟移植、射頻消融治療等[1,2]。但是當(dāng)肝癌發(fā)展到晚期后僅有15%的癌癥患者適合外科手術(shù)，且只有33%～50%的患者可以存活5年[9]。因此，尋找有效的肝癌治療手段就顯得十分緊迫。

LncRNAs具有多種生物學(xué)功能，在信使RNA前體剪切、基因表達(dá)調(diào)控以及染色質(zhì)修飾等方面都起著重要的作用[10- 12]。越來越多的研究表明，LncRNAs與癌癥存在緊密聯(lián)系，多種癌癥中都出現(xiàn)了大量的LncRNAs異常表達(dá)情況。在結(jié)腸直腸癌中，有762種LncRNAs的表達(dá)與正常組織存在顯著差異，其中390種上調(diào)表達(dá)、372種下調(diào)表達(dá)[13]。LncRNA MEG3和GHET1的沉默會(huì)影響結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的增殖[14,15]。全基因組分析發(fā)現(xiàn)肝癌中存在2 736種表達(dá)異常的LncRNAs，其中1 757種Lnc RNAs的表達(dá)高于正常組織的2倍以上，979種Lnc RNAs表達(dá)下調(diào)，這揭示了lncRNAs在肝癌中起著重要作用[16]。有研究表明LncRNA TUG1在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，沉默TUG1會(huì)抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。Xu等[18]發(fā)現(xiàn)LncRNA URCH在肝細(xì)胞癌組織和肝細(xì)胞癌細(xì)胞系中都是高表達(dá)的，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了抑制URCH的表達(dá)會(huì)降低細(xì)胞增殖能力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

BANCR作為一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA，其在各種癌癥中的功能也受到了廣泛關(guān)注。BANCR在結(jié)腸直腸癌中的表達(dá)明顯低于正常組織，且過表達(dá)BANCR會(huì)抑制細(xì)胞增殖[19]。有研究還顯示，BANCR在膀胱癌和肺癌中均低表達(dá)，過表達(dá)BANCR會(huì)抑制膀胱癌細(xì)胞增殖促進(jìn)細(xì)胞凋亡；沉默BANCR會(huì)促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖[20,21]。此外，已報(bào)道BANCR在肝癌組織和細(xì)胞系中過表達(dá)，下調(diào)BANCR的表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞系Hep3B細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[22]。從前人的研究中可以看出，BANCR在不同癌癥中的表達(dá)及功能存在一定的差異。一方面這可能是由于不同癌癥的微環(huán)境造成的[22]。另一方面BANCR在各種癌癥中的不同調(diào)控機(jī)制也會(huì)造成BANCR功能的差異。在肺癌中BANCR通過P38和JNK通路實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖調(diào)控與ERK、Raf- 1無關(guān)[21]。但在黑色素瘤中則通過ERK、Raf- 1和JNK通路來實(shí)施細(xì)胞增殖調(diào)控而與P38 通路無關(guān)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞HepG2中，siRNA干擾BANCR后，細(xì)胞增殖率降低，凋亡率增加，進(jìn)一步研究檢測(cè)到增殖標(biāo)記蛋白表達(dá)水平降低，凋亡標(biāo)記蛋白表達(dá)水平升高。這些結(jié)果表明BANCR siRNA可以抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

LncRNAs在癌癥侵襲方面也發(fā)揮著重要作用。LncRNA ANCR表達(dá)的下調(diào)會(huì)抑制結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的侵襲[23]。有數(shù)據(jù)顯示，lncRNA CCAT1可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲[24]。CCAT1在肝細(xì)胞癌中也起著類似的功能，沉默CCAT1后會(huì)導(dǎo)致肝癌細(xì)胞HepG2和MHCC- 97H侵襲能力的降低[25]。BANCR在結(jié)腸直腸癌、膀胱癌和肺癌中都是低表達(dá)的，在1型子宮內(nèi)膜癌卻是高表達(dá)，而且BANCR表達(dá)的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞侵襲受阻[26]。與本研究結(jié)果一致，BANCR siNRA可減少肝癌細(xì)胞HepG2侵襲細(xì)胞數(shù)目，降低侵襲標(biāo)記蛋白的表達(dá)水平。本研究結(jié)果表明，BANCRsiNRA可抑制肝癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。

血管新生在腫瘤的生長(zhǎng)過程中起著十分重要的作用，越來越多的癌癥治療策略關(guān)注在血管新生相關(guān)因子方面[27- 29]。許多LncRNAs都可以調(diào)節(jié)癌癥的血管新生。Huang等[30]發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1可以促進(jìn)甲狀腺癌的血管新生。有研究表明，LncRNA CRNDE的沉默會(huì)抑制肝母細(xì)胞瘤的血管新生[31]。有數(shù)據(jù)顯示，沉默惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG和U251MG中l(wèi)ncRNA TUG1的表達(dá)，會(huì)大大降低促血管新生因子VEGFA的表達(dá)[32]。許多文獻(xiàn)報(bào)道了IFN- γ具有抗腫瘤的作用。有數(shù)據(jù)顯示IFN- γ可以抑制胃癌細(xì)胞增殖來起到抗腫瘤的作用[33]。在膽囊癌中，IFN- γ具有抑制血管新生的功能[34]。本研究發(fā)現(xiàn)BANCR siNRA干擾HepG2后，會(huì)抑制血管新生能力，抑制促血管新生因子VEGF、bFGF表達(dá)，促進(jìn)IFN- γ的表達(dá)，提示BANCRsiNRA可抑制肝癌細(xì)胞的血管新生。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)BANCR在肝癌細(xì)胞HepG2中高表達(dá)，BANCR siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2后，細(xì)胞增殖倍數(shù)降低，細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞侵襲能力和血管新生能力降低。BANCR siRNA顯著抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白PCNA、侵襲標(biāo)記蛋白MMP- 9、Fn和Vimentin和促血管新生因子VEFG、bFGF表達(dá)，促進(jìn)血管抑制因子INF- γ的表達(dá)并促進(jìn)了細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白Caspase- 3的表達(dá)。本文通過siRNA干擾肝癌細(xì)胞系HepG2中BANCR的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生存能力和運(yùn)動(dòng)能力及血管新生，下一步研究計(jì)劃將建立HepG2腫瘤小鼠模型，在體內(nèi)研究BANCR對(duì)肝癌增殖、遷移和血管新生的影響，并尋找BANCR的作用靶點(diǎn)建立相應(yīng)的信號(hào)通路為尋找有效的生物靶向藥物提供新的方向。

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