陳春艷 劉紫玲 余 斕 陳列松 曾燚華 游曉星 朱翠明

(南華大學病原生物學研究所，特殊病原體防控湖南省重點實驗室，衡陽 421001)

肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae，Mp)是兒童呼吸道感染常見的病原體，主要引起支原體肺炎、氣管炎、支氣管炎等，并與哮喘的發(fā)病密切相關[1- 3]。Mp無細胞壁，其侵入機體后主要通過細胞膜上的脂質相關膜蛋白和菌體外的莢膜多糖(Capsular polysaccharides,CPS)與宿主細胞相互作用。目前國內外對Mp致病機制的研究主要集中在脂質相關膜蛋白[4- 6]，對CPS的研究較少。在Mp感染致病的過程中，CPS除了抗吞噬和抵抗有害物質的損傷外，是否還有其他的功能？目前尚不清楚。

樹突狀細胞特異性細胞間黏附分子- 3- 結合非整合素分子(Dendritic cell- specific intercellular adhesion molecule- 3- grabbing nonintegrin，DC- SIGN)是一種模式識別受體和黏附受體，主要表達于樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)表面。近年研究發(fā)現(xiàn)，許多病原菌，如肺炎鏈球菌、結核分枝桿菌、幽門螺桿菌、人類免疫缺陷病毒、利什曼原蟲等均能與DC- SIGN結合，激活后續(xù)信號通路，使病原體逃避宿主的免疫防御，導致慢性持續(xù)性感染[7- 10]。

我們前期發(fā)現(xiàn)Mp 的CPS也是DC- SIGN的病原相關模式分子[11]。本實驗擬初步研究CPS對DC吞噬功能和表達膜分子表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料 Mp菌株(Strain M129,ATCC 29342)。CM403培養(yǎng)基(Oxoid)；Phase Lock Gel Light購自天根生化科技有限公司；人淋巴細胞分離液購自天津TBD 公司；鼠抗DC- SIGN特異性抗體(Novus Biologicals)；重組人GM- CSF和IL- 4(R&D)。APC- Mouse Anti- Human CD11c、PE Mouse Anti- Human CD80、PerCP- CyTM5.5 Mouse Anti- Human HLA- DR、APC Mouse Anti- Human CD83、FITC Mouse Anti- Human CD86均為BD公司產品。

1.2方法

1.2.1Mp CPS的提取 培養(yǎng)Mp M129菌株，4℃ 12 000 r/min離心20 min收集菌體。按文獻[12]抽提CPS。方法如下：將1 L Mp離心后收集的沉淀用含10%葡萄糖的PBS洗滌2次后重懸于10 ml洗滌液中，加入等體積苯酚混勻，60℃孵育30 min，6 000 r/min離心30 min后移取水相和交界面，重復離心至液體澄清。將其透析過夜后在透析液中加入100 μg RNAase A和40 U DNAase Ⅰ、Ⅱ，37℃靜置18 h。再加入5 g/L SDS和100 μl 蛋白酶K，45℃孵育 24 h。在透析液中加等體積的苯酚/氯仿混合物，混勻后移至含phase- lock gel的離心管離心，吸取水相，加入等體積氯仿后再次離心，取上清，用蒸餾水透析 4 d。在透析液中加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉和4倍體積無水乙醇，離心棄上清，沉淀(即為抽提的CPS)用100 μl滅菌蒸餾水溶解，苯酚硫酸法定量，置-70℃保存?zhèn)溆?。實驗前用PBS稀釋至相應濃度。

1.2.2外周血單核細胞來源的DC的培養(yǎng) 將20 ml 健康人靜脈血用等量D- Hank′s液稀釋。用密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞，分離的細胞用RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，2 mmol/L L- 谷氨酰胺,20 ng/ml重組人IL- 4,10 ng/ml 重組人GM- CSF)調整細胞數(shù)至1×106ml-1，將其加入皮氏培養(yǎng)皿，置CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，隔天半量換液。培養(yǎng)至第6天后，將皮氏培養(yǎng)皿中細胞轉移到細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜(以去除貼壁的巨噬細胞)，收集培養(yǎng)7 d的細胞，調整細胞數(shù)至1×106ml-1，將其轉至24孔板，每孔0.5 ml。細胞用吉姆薩染色后顯微鏡觀察形態(tài)，并以APC mouse anti- Human CD11c抗體染色，F(xiàn)CM檢測DC純度。

1.2.3iDC吞噬功能檢測 實驗共分四組：①15 μg/ml CPS刺激培養(yǎng)7 d的DC；②15 μg/ml CPS 刺激DC- SIGN單抗(1∶100)預處理30 min后的DC；③DC- SIGN單抗(1∶100)刺激的DC;④PBS處理的DC。分組刺激DC 24 h，1 000 r/min離心10 min 收集細胞，PBS洗滌2次。用1 ml含5%胎牛血清的PBS重懸細胞，加入終濃度為1 mg/ml的FITC- 多聚糖，37℃孵育30 min。細胞用預冷的FACS緩沖液洗滌2次，F(xiàn)CM檢測熒光強度。

1.2.4DC表面膜分子檢測 實驗分組和處理同1.2.3。24 h后收集細胞，用預冷的FACS緩沖液洗滌2次。分裝，每管100 μl。用流式抗體APC- CD83、PerCR- cy5.5- HLA- DR、PE- CD80和FITC- CD86及其相對應的同型抗體染色，4℃孵育30 min。用預冷的FACS緩沖液1 200 r/min離心5 min洗滌細胞，重復2次。棄上清，每管加入300 μl FACS緩沖液，F(xiàn)CM檢測DC表面膜分子的表達。

2 結果

2.1樹突狀細胞的培養(yǎng)及鑒定 DC細胞培養(yǎng)7 d后，大部分呈克隆集落狀，可見樹突狀突起(圖1)。FCM檢測分離培養(yǎng)出的DC表面CD11c分子的陽性率為86.27%。

2.2CPS對DC吞噬功能的影響 用CPS刺激DC，F(xiàn)CM分析DC吞噬的FITC- 多聚糖平均熒光強度，檢測DC的吞噬功能。結果顯示CPS刺激組DC 較對照組DC吞噬的FITC- 多聚糖平均熒光強度顯著增加(P<0.05)。若用DC- SIGN單抗預先封閉30 min，再用CPS刺激DC，細胞內FITC- 多聚糖平均熒光強度較DC- SIGN未封閉組DC顯著降低(P<0.05)，且與對照組DC差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2、3。

圖1 人外周血PBMC來源的DC吉姆薩染色觀察(×400)Fig.1 Dendritic cells derived from human peripheral blood mononuclear cells(Giemsa staining,×400)

圖2 不同處理組DC吞噬能力的流式檢測結果Fig.2 FCM detect phagocytosis of DC under differ- ent treatments

圖3 不同處理組DC吞噬FITC- 多聚糖的熒光平均值(n=3)Fig.3 Fluorescence means of FITC- dextran uptake by DC with different treatments(n=3)

2.3CPS刺激對DC表面膜分子的影響 培養(yǎng)7 d的DC用CPS刺激，F(xiàn)CM檢測DC表面膜分子CD83、HLA- DR、CD80和CD86表達水平變化，結果發(fā)現(xiàn)與對照理組DC相比，CPS刺激組DC表面四種膜分子陽性百分率均顯著下降(P<0.05)。用DC- SIGN封閉抗體預先處理后，再用CPS刺激DC，其表面四種膜分子的表達較CPS處理組DC顯著降低(P<0.05)，與PBS處理組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4、5。

圖4 FCM分析不同處理組DC 四種膜表面分子表達Fig.4 FCM analyzed expression of CD83,HLA- DR,CD80 and CD86 on different treated DC

圖5 不同處理組四種膜表面分子的表達(n=3)Fig.5 Expression of CD83,HLA- DR,CD80 and CD86 on different treated DC(n=3)Note: *.P<0.05.

3 討論

DC 是功能最強的專職性抗原提呈細胞，表達多種膜分子，其中CD83是DC標志性分子，主要表達于成熟DC；HLA- DR屬HLA- Ⅱ類分子，可輔助DC提呈抗原；CD80(B7- 1)和CD86(B7- 2)是DC細胞活化的協(xié)同刺激分子，作為第二信使激活初始T細胞。未成熟DC主要分布在機體器官及非淋巴組織的上皮中，其Fc和甘露糖受體表達水平高，而HLA- Ⅱ類分子和協(xié)同刺激分子表達水平低，故未成熟DC攝取抗原的能力強，提呈抗原的能力弱；受抗原等刺激后，DC逐漸分化成熟，成熟DC表面CD83、MHCⅡ類分子、協(xié)同刺激分子等的表達顯著增高，而Fc受體等表達減少，故而成熟DC攝取抗原的能力降低，但提呈抗原的能力增強[13- 15]。

我們的實驗發(fā)現(xiàn)用CPS刺激DC后，其吞噬功能顯著增強，但CD83、HLA- DR、CD80和CD86的表達水平降低，這表明CPS可抑制體外培養(yǎng)DC的自然成熟。用單抗預先封閉DC- SIGN后再用CPS刺激DC，其吞噬功能和四種膜分子的表達水平與對照組相比無顯著改變，這些結果說明，CPS抑制DC成熟是通過結合DC- SIGN發(fā)揮作用。

Mp是一種胞外寄生菌，其感染機體后，黏附在呼吸道上皮細胞表面生長繁殖，產生毒性代謝產物致病。但研究顯示，Mp亦可通過其頂端結構侵入宿主細胞，在細胞內合成DNA并生長繁殖，并能在感染宿主細胞內長期存活，引起慢性持續(xù)性感染[16,17]，其胞內兼性寄生機制目前尚不完全清楚。本實驗發(fā)現(xiàn)CPS通過DC- SIGN可抑制DC成熟，從而抑制DC將Mp抗原提呈給初始T細胞，減弱特異性免疫應答。此外Mp的CPS與DC- SIGN結合可促進IL- 10的分泌，故CPS激活的DC- SIGN信號通路可能與Mp在機體內的持續(xù)性感染有關[11]。

有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)Mp的脂質相關膜蛋白與DC表面的Toll樣受體結合后，能促進其表達CD83、HLA- DR、CD80和CD86分子[18]。DC- SIGN和Toll樣受體兩條通路之間存在串話[19- 20]，Mp CPS激活的DC- SIGN信號通路和脂質相關膜蛋白激活的Toll樣受體通路之間是否也存在串話？還有待于進一步研究。

[1] Waites KB,Talkington DF.Mycoplasma pneumoniae and its role as a human pathogen [J].Clin Microbiol Rev,2004,17(4):697- 728.

[2] Parrott GL,Kinjo T,Fujita J.A compendium for mycoplasma pneumonia [J].Front Microbiol,2016,7(7):513- 528.

[3] Chaabane N,Coupez E,Buscot M,etal.Acute respiratory distress syndrome related to Mycoplasma pneumoniae infection [J].Respiratory Med Case Reports,2016,20(20):89- 91 .

[4] Shimizu T,Kida Y,Kuwano K.Mycoplasma pneumoniae- derived lipopeptides induce acute inflammatory responses in the lungs of mice [J].Infect Immun,2008,76(1):270- 277.

[5] Shimizu T,Kida Y,Kuwano K.A dipalmitoylated lipoprotein from Mycoplasma pneumoniae activates NF- kappa B through TLR1,TLR2,and TLR6 [J].J Immunol,2005,175(7):4641- 4646.

[6] Hu J,Chen C,Ou G,etal.Nrf2 regulates the inflammatory response,including heme oxygenase- 1 induction,by Mycoplasma pneumoniae lipid- associated membrane proteins in THP- 1 cells [J].Pathog Dis,2017,75(4):1- 7.

[7] Park JY,Choi HJ,Prabagar MG,etal.The C- type lectin CD209b is expressed on microglia and it mediates the uptake of capsular polysaccharides of Streptococcus pneumonia [J].Neurosci Lett,2009,450(3):246- 251.

[8] Srivastava V,Vashishta M,Gupta S,etal.Suppressors of cytokine signaling inhibit effector T cell responses during Mycobacterium tuberculosis infection [J].Immunol Cell Biol, 2011,89(7):786- 791.

[9] Di Gianvincenzo P,Chiodo F,Marradi M,etal.Gold manno- glyconanoparticles for intervening in HIV gp120 carbohydrate- mediated processes [J].Methods Enzymol,2012,509(509):21- 40.

[10] Gringhuis SI,den Dunnen J,Litjens M,etal.Carbohydrate- specific signaling through the DC- SIGN signalosome tailors immunity to Mycobacterium tuberculosis,HIV- 1 and Helicobacter pylori [J].Nat Immunol,2009,10(10):1081- 1088.

[11] 劉紫玲,游曉星,彭志平,等.肺炎支原體莢膜多糖與DC- SIGN結合并促進IL- 10的分泌 [J].細胞與分子免疫學雜志,2013,29(1):10- 13.

Liu ZL,You XX,Peng ZP,etal.Mycoplasma pneumoniae capsular polysaccharides bind to DC- SIGN and promotethe secretion of IL- 10[J].Chin J Cell Mol Immunol,2013,29(1):10- 13.

[12] Waite ER,March JB.Capsular polysaccharide conjugate vaccines against contagious bovine pleuropneumonia:Immune responses and protection in mice [J].J Comp Pathol,2002,126(2- 3):171- 182.

[13] 劉劍雯,曾志勇,陳君敏.人外周血耐受性樹突狀細胞的誘導培養(yǎng)及其DC- STAMP的表達研究[J].中國免疫學雜志,2013,29(5):474- 480.

Liu JW,Zeng ZY,Chen JM.Induction culture of tolerogenic dendritic cells from human peripheralblood and their DC- STAMP expression[J].Chin J Immunol,2013,29(5):474- 480.

[14] Park J,Babensee JE.Differential functional effects of biomaterials on dendritic cell maturation [J].Acta Biomater,2012,8(10):3606- 3617.

[15] Collin M,McGovern N,Haniffa M.Human dendritic cell subsets [J].Immunology,2013,140(1):22- 30.

[16] Hubo M,Trinschek B,Kryczanowsky F,etal.Costimulatory molecules on immunogenic versus tolerogenic human dendritic cells [J].Front Immunol,2013,4(4):82- 82.

[17] Yavlovich A,Tarshis M,Rottem S.Internalization and intracellular survival of Mycoplasma pneumoniae by non- phagocytic cells [J].FEMS Microbiol Lett,2004,233(2):241- 246.

[18] Dallo SF,Baseman JB.Intracellular DNA replication and long- term survival of pathogenic mycoplasmas [J].Microb Pathog,2000,29(5):301- 309.

[19] 歐廣利,劉紫玲,譚田平,等.肺炎支原體脂質相關膜蛋白促進樹突狀細胞成熟 [J].細胞與分子免疫學雜志,2015,31(7):941- 944.

Ou GL,Liu ZL,Tan TP,etal.Lipid- associated membrane proteins of mycoplasma pneumoniae promotedendritic cells to mature[J].Chin J Cell Mol Immunol,2015,31(7):941- 944.

[20] Caparrós E,Serrano D,Puig- Kr?ger A,etal.Role of the C- type lectins DC- SIGN and L- SIGN in Leishmania interaction with host phagocytes [J].Immunobiology,2005,210(2- 4):185- 193.

[21] Keller CW,Freigang S,Lünemann JD.Reciprocal crosstalk between dendritic cells and natural killer T cells:mechanisms and therapeutic potential [J].Front Immunol,2017,8(8):570- 570.